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中药组方对PRRS防控效果的评价
张 帅 1，代 飞 2，王敬友 2，赵云环 1，王荣申 3，宫新城 1，范京惠 1 *，左玉柱 1 *
（1.河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001；2.河北科星药业有限公司，河北 石家庄 050200；3.石家庄市动物疫病预防控制中心，河北 石家庄 050300）
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起的一种烈性传染病，俗称“猪蓝耳病”，临床以引起母猪的繁殖障碍以及不同年龄段猪只呼吸道疾病为主要特征。PRRS为免疫抑制性疾病，感染猪免疫系统受损、免疫力下降，易继发其他病原体感染，使得临床症状加重。目前我国流行的PRRSV毒株主要是NADC-30 like、NADC-34 like等类高致病性毒株。由于减毒活疫苗的广泛使用，返强毒株普遍存在，且PRRSV存在多个谱系毒株，毒株频繁重组，造成了猪场毒株呈现多样性和复杂性。此外，PRRSV可通过感染猪只的唾液、鼻腔分泌物、粪尿及精液排出，妊娠后期感染的母猪还可通过乳汁排毒，一旦感染，将造成猪场大面积传播，使防控难度大大增加，严重威胁养猪业的健康发展，给养猪业造成了巨大的经济损失。
从中兽医学角度分析，导致该疾病高发的原因是“虚邪共济”。天气炎热之时，气候较为潮湿，生猪外感湿热化火，机体易升降失常、肺气不宣以及阴阳失调。同时，处于哺乳期的仔猪在感染PRRSV时发病率和死亡率较高，主要因为仔猪五脏处于“虚”时，抵御病毒能力较差，容易出现病毒乘虚而入的情况，导致邪盛正衰，治疗难度大，加之传染性较强，因此极易出现高感染率和死亡率。PRRS属于温热病的范畴，所以应用中兽医理论进行疾病治疗时还应遵循清肺止咳、清热解毒的治疗原则，同时做好消炎抑菌、扶正祛邪等工作，以获得理想的治疗效果。中兽药中，党参具有健脾益肺、养血生津之效，白术可健脾燥湿、安胎抗炎，茯苓利水渗湿、健脾宁心，知母清热泻火、滋阴润燥。几种中药组成方剂，可加强脾胃的运化功能，提高机体免疫力，在PRRS防控方面将具有良好的应用前景。
为了研制一种防控PRRS的有效中药组方，本研究利用中兽医原理，结合PRRS对猪体的危害，以党参、白术、茯苓、知母等6种药物组方，选择断奶仔猪进行治疗效果和预防效果试验。治疗效果试验中，用药组仔猪在与PRRSV阳性猪同群饲养7 d后用药；预防效果试验中，用药组仔猪在与PRRSV阳性猪同群饲养开始即用药，同时分别设与PRRSV阳性猪同群饲养，但不用药的阳性对照，以及未感染的阴性对照。对各实验组仔猪进行血液、组织中的病毒载量分析，发现该药物的使用，在一定程度上抑制了PRRSV在仔猪体内的增殖，对PRRS有一定的治疗和预防作用。从仔猪的临床表现及生长状况分析，发现该药物越早使用越有利于减轻PRRS症状，对猪场PRRS进行有效防控。
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材料与方法
1.1 试验动物
18头25日龄断奶仔猪，无PRRSV及其他病原体感染，且PRRSV抗体阴性。
1.2 主要试剂耗材
PRRSV、猪乙脑病毒（JPEV）、猪瘟病毒（CSFV）实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环2型病毒（PCV2）实时荧光定量PCR检测试剂盒，购自湖南国测生物技术有限公司；PRRSV ELISA抗体检测试剂盒，购自爱德士瑞士生物科技有限公司；DNA/RNA核酸提取及纯化试剂盒，购自湖南冠牧生物科技有限公司。
1.3 试验仪器
高速冷冻离心机，上海力申科学仪器有限公司产品；超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；荧光定量PCR仪，西安天隆科技有限公司产品。
1.4 试验动物检测
对18头25日龄断奶仔猪，进行耳缘静脉采血，使用DNA/RNA核酸提取及纯化试剂盒提取核酸，实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒进行PRRSV、JPEV、CSFV检测，实时荧光定量PCR检测试剂盒进行PPV、PRV和PCV2检测，以确定试验仔猪无以上病原体感染；使用PRRSV ELISA抗体检测试剂盒进行PRRSV抗体检测，以确定试验仔猪PRRSV抗体阴性。
1.5 试验分组及用药
治疗效果试验中，仔猪随机分为PRRSV阳性对照组、用药组和阴性对照组，每组3头。阳性对照组和用药组仔猪均为与已知PRRSV阳性猪同群饲养自然感染，用药组仔猪与阳性猪同群饲养7 d后开始用药，每头3 g/d，拌料饲喂；阴性对照组不做感染和用药处理，各组仔猪饲养条件相同。预防效果试验中，仔猪随机分为PRRSV阳性对照组、用药组和阴性对照组，每组3头。阳性对照组和用药组仔猪均为与已知PRRSV阳性猪同群饲养自然感染，用药组仔猪在与PRRSV阳性猪同群饲养开始即用药，每头3 g/d，拌料饲喂；阴性对照组不做感染和用药处理，各组仔猪饲养条件相同。
1.6 临床指标观察
阳性对照组和用药组与已知PRRSV阳性猪同群饲喂开始记为试验第1天，连续14 d观察并记录试验仔猪的精神状态、采食量、体温、死亡率等临床指标。
1.7 临床材料采集
对两批试验仔猪试验第7、10、13天进行耳缘静脉采血，做好相关记录；14 d后采集肺脏、脾脏、淋巴结等组织进行研磨，并做好分组相关记录，8 000 r/min 离心10 min，分离组织研磨液上清，置于-20℃备用。
1.8 PRRSV检测
对于试验进行第7、10、13天采集的血液，使用DNA/RNA核酸提取及纯化试剂盒提取核酸，通过实时荧光定量RT-PCR检测血液中PRRS病毒血症情况；对于分离的感染14 d组织研磨液上清，使用DNA/RNA核酸提取及纯化试剂盒提取核酸，通过实时荧光RT-PCR检测组织中PRRSV病毒载量。
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试验结果
2.1 试验动物检测结果
对18头25日龄断奶仔猪，分别使用实时荧光定量RT-PCR及实时荧光定量PCR检测试剂盒进行PRRSV、JPEV、CSFV、PPV、PRV和PCV2检测，结果显示PRRSV、JPEV、CSFV、PPV、PRV和PCV2均为阴性（表1）；使用PRRSV ELISA抗体检测试剂盒进行PRRSV抗体检测，结果显示18头试验仔猪PRRSV抗体阴性（表2），表明该18头仔猪可用于试验。
2.2 临床指标观察结果
治疗效果试验仔猪，试验开始后的第1天和第2天，采食量正常，精神状态良好，体温正常；阳性对照组和用药组第3天开始出现轻微咳嗽、鼻腔溃疡及呼吸道症状，采食量下降，精神沉郁；第6天开始，阳性对照组有2头仔猪体温升高，皮肤发红；用药组在用药后临床症状并未得到明显转归；阴性对照组仔猪采食量、体温和精神状态均正常，未表现PRRS的典型临床症状。治疗效果试验期间，各组均无仔猪死亡。
预防效果试验仔猪，试验开始后的第1天和第2天，各组均采食量正常，体温正常，精神状态良好，阳性对照组仔猪在试验第3～7天出现严重便秘，咳嗽，背毛粗糙，采食量明显下降，体温升高，第9天，死亡一头仔猪，死亡率为33.33％；用药组仔猪则仅表现轻微便秘，背毛光亮，采食量、体温和精神状态均正常，无死亡情况；阴性对照组仔猪，试验中所检查的各项指标均正常，未表现PRRSV典型临床症状，无死亡情况。
2.3 PRRSV核酸检测结果
对治疗效果试验和预防效果试验仔猪第7、10、13天采取的血液进行实时荧光RT-PCR检测，结果显示，两批仔猪，试验第7天均已感染PRRSV（图1），治疗效果试验中（图1-A），阳性对照组和用药组仔猪第10、13天血液病毒载量均升高，但用药组仔猪血液PRRSV病毒载量低于阳性对照组仔猪，且病毒载量上升的速率低于阳性对照组仔猪，表明该方剂对PRRSV增值有抑制作用，对PRRS的治疗有一定效果。预防效果试验中（图1-B），阳性对照组和用药组仔猪第10、13天血液病毒载量同样升高，但用药组仔猪血液PRRSV病毒载量同样低于阳性对照组仔猪，预防效果与治疗效果趋势相似，表明该组方对PRRS亦有一定的预防作用。阴性对照组检测无Ct值，表明阴性对照组仔猪无PRRSV感染。
对于试验进行14 d后的仔猪组织研磨液进行实时荧光RT-PCR检测PRRSV，结果显示（图2），治疗效果试验和预防效果试验仔猪用药组组织研磨液中病毒量均明显低于阳性对照组（P＜0.01），阴性对照组检测无Ct值，表明阴性对照组仔猪无PRRSV感染。
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讨论
PRRS至今仍是威胁养猪业的重要疫病之一，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。当前防控PRRS主要以接种疫苗为主，我国免疫2～3次PRRS疫苗的猪场占67％，也正是疫苗高接种率造成了猪场大面积感染，尤以长期免疫弱毒活苗猪场为主。究其主要原因是猪只自身感染病毒毒株与PRRS疫苗毒株，疫苗毒与野毒之间可能发生基因重组导致毒株多形性，加之疫苗毒在猪场循环和传播，导致PRRS的防控难度大大增加。PRRSV可通过破坏呼吸道粘膜及纤毛、抑制肺泡巨噬细胞和血管内巨噬细胞的吞噬作用、改变T淋巴细胞亚群来降低机体免疫机能，造成免疫抑制，从而继发其他病原体感染。猪场常见疫病如PCV、PRV以及支原体等感染与PRRSV感染有密不可分的关系，因此，急需特效药来预防和治疗PRRS。孙耀贵等研究发现党参可通过保护肝细胞、改善肝功能、提高免疫反应及抗氧化等多种途径共同增强机体的免疫功能；潘美霖研究发现白术可提高巨噬细胞增殖能力与吞噬能力，对PRRSV具有阻断、抑制、杀灭作用；尹天福等综述了茯苓等中药能调理母猪免疫平衡，维持蓝耳病抗体水平稳定和解除蓝耳免疫抑制；冼琼珍等采用对PRRSV的阻断、抑制和直接杀灭3种方式观察16种中药体外抗PRRSV的作用发现，知母可用于抗PRRSV。以上中药均表现出增强免疫力和抗PRRSV作用，为本研究将党参、白术、茯苓、知母等6味中药进行组方，在减抗替抗大背景下，用以防控PRRS提供一种新的思路和方法。
PRRS属外感温热病范畴，临床发病猪主要表现为持续发热、怀孕母猪流产和呼吸道症状等，中兽医防治则以“增免解毒”、“清热燥湿”、“健脾益肺”为原则。本研究以党参、白术、茯苓、知母等6味中药组方，通过拌料的方式对PRRSV自然感染仔猪进行用药，通过体温、采食量等临床指标和血液、组织研磨液中的PRRSV载量来评价其防控效果。研究发现，治疗效果试验中的仔猪，在与已知PRRSV阳性猪同群饲喂7 d后开始用药，用药组与PRRSV阳性对照组均出现精神沉郁、咳嗽等症状，在用药后并未出现明显症状好转，分析原因可能是此时用药时间过晚，出现临床症状表现后不容好转。在PRRSV检测中，发现试验第7天均已感染PRRSV，第10、13天病毒量仍在上升，可能是由于PRRSV仔猪体内病毒增殖并未达到巅峰。但值得注意的是，用药组仔猪PRRSV载量上升的速率明显缓于阳性对照组，表明该组方对于PRRSV的增殖有一定减缓和抑制作用，对PRRS的治疗有一定效果；预防效果试验中，阳性对照组仔猪表现出明显的PRRS症状，而用药组仔猪则精神正常，仅表现轻微便秘，其他临床指标同阴性对照仔猪。检测仔猪血液PRRSV载量时，发现用药组在试验开始时病毒载量即低于阳性对照组，可能是在中药作用下，机体免疫力增强，抑制了病毒入侵与增殖，且该抑制作用一直持续到试验结束，表明该组方对于PRRS的预防可起到一定作用。对试验仔猪组织研磨液的PRRSV检测结果显示，治疗效果试验和预防效果试验的仔猪用药组PRRSV载量均明显低于阳性对照组（P＜0.05），表明本研究的中药组方对PRRS的预防和治疗均有一定的效果；治疗和预防试验效果对比显示，预防效果试验用药组病毒载量和临床症状改善程度均明显强于治疗效果试验（P＜0.05），因此，用药越早，越有利于PRRS的防控。
PRRSV作为一种高度传染性疾病，已成为全球养猪业面临的主要难题之一。本研究通过党参、白术、茯苓、知母等6味中药组方给药PRRSV感染仔猪，发现虽不能完全抑制PRRSV的增殖，但收到了一定预防和治疗效果，且该组方越早使用，越有利于抑制病毒增值，减轻PRRS症状，为PRRS的防控提供新的思路与帮助。
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