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文章介绍了2022年商品肉鸡H9N2亚型禽流感病毒在山东地区的流行情况。选取15株分离鉴定的H9N2亚型禽流感毒株，对其HA基因进行序列测定和分子特征分析，并应用软件Mega6.0绘制HA基因进化树，进行遗传进化分析。结果表明，15株H9N2分离毒的HA裂解位点氨基酸均为RSSR/GLF，具有典型低致病性AIV HA基因的特征；其第234位氨基酸均为亮氨酸（L），因此就具有了结合人流感受体的分子特性。进化树分析表明，2022年山东地区15株H9N2流行毒株HA基因属于4.2.5分支，细分为近几年在中国鸡群中流行的4.2.5a和4.2.5.c亚分支。
H9N2是A型流感病毒的一个亚型，具有高度空气传播性，可引发商品肉鸡流感，同时该病毒还严重影响人类公共卫生安全。我国自1998年就开始进行H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的防疫，但目前其疫苗株与流行株的抗原性已经出现了较大的差异[1]。商品肉鸡因养殖密度大、通风不良等原因，冬春季极易引起流行，造成生产中的严重损失。虽然H9N2亚型流感病毒属于低致病性，但与大肠杆菌、支原体等混合感染后可引起免疫抑制和死亡增多，造成肉鸡养殖业的巨大经济损失[2]。
H9N2禽流感病毒自1966年首次在美国分离后，逐渐在北美、亚洲、中东、非洲和欧洲许多国家家禽体内发现，根据地理位置不同可分为北美和欧亚两个体系。目前该病在亚洲地区分布较广。
1994年我国广东地区首次公开报道H9N2亚型禽流感病毒。HA基因是A型流感病毒致病性的主要影响因子。根据HA序列，将H9N2分为h9.1～h9.4，共4个主干进化分支。当前，我国流行的主要为h9.4.2.5和h9.4.2.6两个分支，但仍以h9.4.2.5为主。本文选取了来自山东地区发病商品肉鸡分离的15株H9N2禽流感病毒，用特异性引物对HA基因进行扩增并测序，比对其HA基因同源率，探讨HA基因遗传演化特点，为商品肉鸡低致病性禽流感H9N2的防控提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 毒株
15株H9N2亚型商品肉鸡分离株由广东省华晟生物技术有限公司分离鉴定保存，方法参照文献[3]，并分别命名为A/CK/SD/11/2022/H9N2、A/CK/SD/15/2022/H9N2、A/CK/SD/16/2022/H9N2、A/CK/SD/17/2022/H9N2、A/CK/SD/19/2022/H 9 N 2、A/CK/SD/21/2022/H 9 N 2、A/C K/SD/29/2022/H9N2、A/CK/SD/30/2022/H9N2、A/CK/SD/31/2022/H9N2、A/CK/SD/32/2022/H9N2、A/CK/SD/50/2022/H9N2、A/CK/SD/51/2022/H 9 N 2、A/CK/SD/52/2022/H 9 N 2、A/C K/SD/53/2022/H9N2、A/CK/SD/54/2022/H9N2。
H9-2203-C(4.2.5c）、HeB210813-2F6-b(4.2.5b）、H9-2102-a(4.2.5a）参考毒株HA序列由华南农业大学兽医学院提供。
1.2 主要材料和试剂
SPF鸡（胚）由广东新兴大华农禽蛋有限公司提供。试验所用分子生物学试剂购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.3引物合成
利用参考文献[3]中的H9N2禽流感病毒HA基因引物序列，由广州核源生物科技有限公司合成，用于扩增HA基因全长序列，预期扩增的HA基因大小为1 687 bp。扩增所用引物序列详见表1。
1.4 病毒RNA的提取以及RT-PCR扩增、测序
参照试剂盒说明书进行病毒RNA提取。RT-PCR扩增、连接克隆、序列测定参照文献提出的方法进行[4]。
1.5 遗传进化分析
15株分离毒株、8株H9N2禽流感参考毒株的HA基因序列（表2）以及华南农业大学兽医学院提供分型的3株H9N2毒株HA基因序列，用MEGA6.0进行遗传演化分析，绘制系统进化发育树。
2 结果
2.1 HA基因的同源性和遗传分析
将11株（8+3）参考毒株与15株H9N2病毒分离株的HA基因进行遗传演化分析，获得如图1所示的进化树。
从图1进化树可以看出，15株分离毒株均属于4.2.5分支，细分为2个亚分支。其中，12株分离毒株属于4.2.5c分支，3株分离毒株属于4.2.5a分支。图2中，15株H9N2分离毒株之间的HA序列相似性在93.3%～99.9%之间。同一亚分支4.2.5a分支间的毒株相似性在99.8%～99.9%之间，4.2.5c分支间的毒株相似性在95.6%～99.9%之间，差异较小，但不同亚分支间的毒株相似性差异较大。根据以往经验，相似性差异大于1.5%就能形成分支间的差异，因此分析这些毒株的抗原性可能也会存在明显差异。
2.2 关键点分析
15株分离株的HA裂解位点呈现弱毒株的序列特征，均为RSSR↓GLF。受体结合位点分析发现W161和G236符合其绝对保守氨基酸位点的特征，没有出现其他氨基酸的突变。12株病毒（11/15/16/17/19/30/50/51/52/53/54）在163位点为N突变，3株病毒（29/31/32）在163位点为T突变，198位点均为V突变。所有分离株存在234L和236G（表3）。以上突变位点均与受体特异性相关，说明所有分离株都有感染哺乳动物的风险。
3 讨论
流感病毒的HA基因裂解位点氨基酸序列是其致病性和毒力的主要影响因子[5]。本研究中15个H9N2分离毒株的HA基因裂解位点具有低致病性流感病毒分子特征，裂解位点氨基酸序列为RSSR↓GLF，没有连续的多个碱性氨基酸插入。
测序鉴定的15株H9N2毒株均属于4.2.5分支，此分支是当前国内商品肉鸡H9N2病毒的主要流行分支。病毒分布在4.2.5分支内部的2个亚分支中，2个分支之间病毒的HA基因存在明显的相似性差异，暗示病毒的抗原性之间也可能存在较大差异。Sun等[6]发现，H9N2病毒流行株同源性之间呈现时间和地理位置的一致性；不同的是，较早期病毒均有不同程度的变异和进化。本研究中，通过对15株H9N2分离毒HA基因进化树分析可知，从地理位置上分离毒呈现出两种不同的同源性关系，从分支上隶属于4.2.5a和4.2.5c亚分支，出现了地理位置的不一致性。当前国内商品肉鸡使用的H9N2灭活疫苗基本是单一毒株，抗体交叉可能存在差异，提示肉鸡场需要兼顾两种不同亚分支毒株的免疫。
H9N2禽流感病毒对公共安全也有潜在威胁[7]。15株分离毒株的HA基因关键位点突变均呈现出典型的人流感受体结合特性，具有234L和236G的特征，以上突变位点均与受体特异性相关，病毒均具备感染哺乳动物的风险，提示相关从业人员应该加强生物安全防护，避免其产生严重的公共危害。
[1]邵明辰，董伟峰，刘兆洁.2022年山东地区商品肉鸡15株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传演化分析[J].家禽科学，2023,45(12):38-42.
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