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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及应用文|李雪平 员晓庆 高小鹏
广州悦洋生物技术有限公司
摘要：猪繁殖与呼吸综合征是生猪养殖中疫病防控的重点和难点，该疫病给我国养殖业造成了巨大的损失。目前，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）疫苗已广泛使用，使用N蛋白抗体试剂盒无法有效评估疫苗免疫效果。本研究基于PRRSV GP5蛋白，建立间接ELISA检测试剂盒用于PRRSV中和抗体检测，评估猪群中疫苗免疫效果。结果：本研究的PRRSV GP5蛋白抗体检测试剂盒具有特异性高、敏感性好、稳定性好，与中和试验有良好的相关性。针对不同免疫情况的猪场进行抗体分析，其检测结果与临床的群体状态评估相符。本研究的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接 ELISA抗体检测试剂盒能够用于临床PRRSV疫苗抗体免疫评估，同时也为PRRSV免疫净化提供有力工具。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；GP5蛋白；间接ELISA；免疫评估01
背景
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种以感染猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，各种年龄猪（特别是仔猪）呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。我国在1996年首次报道，之后经过多次变异重组，在全国各地区猪群中长期流行，且感染率一直居高不下。针对PRRSV，疫苗免疫（如灭活疫苗、弱毒疫苗等）是最主要的防控手段，如何评价灭活疫苗和其他疫苗的免疫效果，对猪群抗体水平进行系统评价，从而合理有序地进行疫苗免疫，这对猪群的疫苗免疫将具有重要应用价值目前，市场上主要流通的是以包被N蛋白为主的蓝耳抗体检测试剂盒，也有包被GP蛋白或M蛋白的蓝耳抗体间接试剂盒，由于依赖国外进口，成本价格较高，采购周期较长的问题，不能快速、有效评价用于猪群自然感染病毒或接种疫苗后的免疫保护水平。GP5蛋白是PRRSV的重要的膜蛋白，具有良好的免疫原性，能够产生中和抗体，可用于评价疫苗免疫。本研究通过大肠杆菌表达系统，表达PRRSV GP5蛋白，并基于该蛋白建立间接ELISA检测方法用于PRRSV中和抗体检测，用于评估猪群中疫苗免疫效果。
02
猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的制备
1 质粒构建
根据猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5的基因序列和氨基酸序列，对目的序列进行疏水性和亲水性，跨膜区和信号肽区域的分析，在保证抗原性和亲水性的同时去掉疏水区和信号肽区域，将根据密码子的兼容性，进行密码子优化，选定BamHI和XhoI克隆位点，将目的基因链接到表达载体质粒pET-32a（+）中，构建重组质粒pET-32a(+)-GP5（见图1），测序结果正确，测序得出GP5基因序列；
图1：构建重组质粒pET-32a(+)-GP5图
2表达鉴定
将重组质粒pET-32a(+)-GP5转化E.coli BL21(DE3)，得到重组表达菌株BL21-GP5，在氨苄抗性的LB平板上进行转化；挑选重组表达菌株pET-32a(+)-GP5单克隆菌，接种到4mL的LB培养基中（终浓度为0.1mM的氨苄），诱导表达鉴定的菌液对比。全菌煮沸后进行鉴定。电泳结果显示（图2，泳道2箭头），确定目的蛋白为能够大量表达。
图2：诱导表达重组菌鉴定图
3可溶性表达鉴定
通过离心收集诱导后的菌体，用PBS重悬菌体沉淀；超声裂解细菌，离心后得到上清和菌体沉淀；将菌体沉淀用与上清同等体积的PBS重悬，得到沉淀悬浮液；上清与沉淀悬浮液分别进行电泳。结果：确定目的蛋白为沉淀包涵体表达。（图3，1泳道为上清，2泳道为沉淀）。
图3：重组菌可溶性表达鉴定图
4纯化鉴定分析
将经鉴定呈阳性表达的重组表达菌株，大量诱导表达；采用亲和层析纯化（Ni-IDA）亲和层析柱，之后用不同咪唑浓度的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集洗脱组分进行SDS-PAGE电泳分析。经Ni-IDA亲和层析纯化后，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度和纯度测定。猪繁殖与呼吸综合征病毒重组GP5蛋白WB鉴定。结果：纯化后的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组GP5蛋白纯度达到95%以上，纯化后蛋白浓度为1.45mg/mL，WB检测具有良好的抗原性（详见图5）。
图4：重组蛋白纯
图5：纯化后蛋白WB结果验证
03
猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法建立ELISA流程：包被液稀释抗原，每个孔加入100μL包被过夜；弃液，洗涤3次拍干，加入封闭液孵育；弃液，洗涤3次，拍干；稀释样本，每孔加入100μL，室温反应，弃液，洗涤3次，拍干；稀释酶标抗体，每孔加入100μL，室温反应；洗涤3次拍干。加入TMB底物显色液100μL/孔，室温反应，加入50μL/孔的终止液，酶标仪测定OD450nm值。
1棋盘法建立体系
按棋盘法，将抗原猪繁殖与呼吸综合征病毒重组GP5蛋白利用棋盘法筛选包被浓度，稀释倍数和酶标抗体稀释倍数。
表1抗原最佳包被浓度、血清最佳稀释度和酶标抗体稀释倍数的P/N范围
通过计算阳性对照血清相对OD450nm值与阴性对照血清相对OD450nm值（P/N值），通过对比不同条件下P/N值范围，确定P/N值相对较大的抗原包被浓度1μg/mL，血清最佳稀释度1:150，酶标二抗的稀释倍数为80000作为ELISA最佳反应条件。
2优化反应条件
在以上测定的最佳实验条件基础上，对样本孵育时间、酶标抗体孵育时间、TMB显色时间进行优化。P/N值计算结果：以阳性样品平均OD450nm值与阴性样品平均OD450nm值的比值（P/N）值相对较大的作最佳反应时间。
通过计算阳性对照血清相对OD450nm值与阴性对照血清相对OD450nm值（P/N值）最大值，而样本孵育时间为30min、酶标抗体孵育时间为30min、TMB显色时间15min的P/N值最大，分别为5.6、4.9、5.9。
3 ELISA临界值cut- offline的确定
将107份正常猪血清样品（海博莱抗体检测阴性样本且猪场从未免疫过蓝耳疫苗）按1:150稀释，在筛选的最佳条件下进行间接ELISA测定，设置阴阳性对照孔，对检测结果进行统计学分析，得到OD450nm，计算S/P值平均值（X）和标准差（SD），将S/P值S/P值≥0.5时，判为阳性；即S/P值＜0.5）判定阴性。
4猪繁殖与呼吸综合征病毒重组GP5蛋白抗体间接ELISA检测的效果评价临床符合率检测，对117份临床免疫灭活疫苗的临床血清，且经Hipra抗体检测阳性的猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清、53份猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性样本（其中猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性样本包括：圆环病毒2型阳性血清、口蹄疫O型阳性血清、口蹄疫A型阳性血清、猪瘟阳性血清和伪狂犬阳性血清各两份，由华医测检测科技有限公司提供）；表2：GP5蛋白抗体试剂盒临床血清符合率试验
检测结果：117份猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清104份阳性，13份为阴性；53份阴性血清中有51份为阴性，2份为阳性。特异性为96.89%，敏感性为88.89%；假阳性率为3.77%，假阴性率为11.11%。圆环病毒2型阳性血清、口蹄疫O型阳性血清、口蹄疫A型阳性血清、猪瘟阳性血清和伪狂犬阳性血清结果均为阴性，无交叉反应。
5 S/P相关性实验
将猪繁殖与呼吸综合征病毒标准血清（中监所）从1：10开始连续2倍倍比稀释，到5120倍，设置阴阳性对照孔，计算S/P值。并S/P值和稀释倍数的相关性，结果表3。
表3：标准血清S/P相关性检测
通过将稀释倍数和S/P数值构建散点图，设置线性回归方程，其中线性回归方程为y = -0.3067x + 3.1582 R2 = 0.9863 R =0.9921。其中R=1为线性关系，本研究的R值接近为0.9921，具有良好的相关性。表明抗体水平和S/P值呈现线性相关性。
6重复性试验
批内和批间重复性试验
不同批次制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组GP5蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，对不同样品进行检测，每种样品重复8次，批内重复和批间重复试验的变异系数为范围3%—7%，均低于10%，表明该试剂盒具有良好的批内重复性和批间重复性。
7稳定性实验
不同批次的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接ELISA抗体检测试剂盒，进行为期15天的37℃的热稳定性实验。4℃保存的试剂盒进行对比。临床样本的OD450nm值的降解率低于30%04
临床免疫评估
案例1
背景信息：某PRRSV阳性稳定猪场的34份血清，分别用两种ELISA方法：悦洋N蛋白间接ELISA抗体试剂盒，该研究建立的GP5蛋白间接ELISA方法分别进行检测，结合病毒中和试验结果进行验证。
结果如表4所示：N蛋白抗体合格率仅为14%，GP5蛋白抗体为85%，病毒中和试验为71%，GP5蛋白抗体具有更高的符合率；而病毒中和试验与体内中和抗体水平是正相关的。
表4：阳性稳定场PRRSV-ELISA检测结果
案例1总结：阳性稳定场检测，N蛋白抗体检测结果无法评价猪群抗体状态，而GP5蛋白对应的是中和抗体，与保护性中和抗体呈正相关，即检测GP5蛋白抗体，可用于评估猪群中和抗体水平。此外，PRRSV相对稳定的猪群，预期临床GP5蛋白抗体合格率在70%以上。
案例2
背景信息：17头4周龄PRRSV抗原抗体双阴性仔猪，首免PRRSV灭活苗，28天后二免。分别在免疫后4周、攻毒后的1周与3周进行GP5蛋白抗体检测。
结果如图6，免疫后4周PRRSV-GP5蛋白抗体（中和抗体）S/P≥0.5的占1/17，呈现比较低的应答水平；受到外来抗原刺激后，94.1%猪只免疫力迅速应答并产生较高水平GP5蛋白抗体。
图6：PRRSV灭活疫苗免疫后攻毒GP5蛋白抗体消长规律
案例2
结论：免疫灭活苗后，尽管GP5蛋白抗体阳性率低，但在野毒侵袭时，可在1周内快速诱发机体产生高水平的中和抗体，GP5抗体检测有明显的消长规律。
案例3
背景信息：3000母猪存栏，以出售猪苗为主，2023年3月份发现母猪群里流产现象，断奶仔猪/保育猪死亡率上升，产房仔猪睾丸液送某第三检测机构测序为PRRSV-NADC30-Like毒株。
免疫程序：2022年5月母猪普免某活苗PRRSV 0.5头份，出现野毒感染。2023年3月、2023年4月中旬分别免疫B灭活苗（普免），免疫一月后，母猪流产得到控制；产房仔猪睾丸液抗原检出率75%减少到2023年7月检出率为25%，排毒得到一定控制；仔猪14日龄免疫某活苗的PRRSV 1头份。PRRSV-GP5抗体检测：分别对其仔猪（24d）、母猪的GP5抗体进行检测，结果见图5、图6；仔猪抗体S/P均值1.6，大部分高于2.0，呈现高水平中和抗体，高度怀疑已被野毒侵袭，弱毒苗免疫后，需要4周左右，GP5抗体才产生；母猪抗体合格率88%，但离散度较大。
图7：仔猪GP5抗体水平分析
图8：母猪GP5抗体水平分析
案例3总结：整体抗体阳性率为94%，呈现较好水平；该场处于阳性不稳定、低流行场过渡到-阳性稳定场的阶段；首要任务是抑制母猪排毒，并继续保持母猪群中和抗体合格率，才能保证哺乳仔猪在产房不会接触到野毒/疫苗毒。
本案例分析：产房仔猪蓝耳病毒GP5的抗体S/P值，母猪GP5抗体S/P值较大的离散度预判，该场存在野毒或疫苗毒循环，后续跟踪证实存在NADC30-Like流行。根据对中和抗体的检测分析，与临床实际情况相符合。表明在猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接 ELISA检测防控、免疫监测具有很好的指示作用。
05
总结展望
猪繁殖与呼吸综合征病毒的发病率在逐年上升，给养猪业带来巨大的经济损失，属于防控难题，除了做好日常的管理的科学化和防护，疫苗免疫是目前效果较好的免疫手段。如何评价疫苗免疫效果是目前PRRSV防控中较为棘手的问题。本项目研发的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接 ELISA检测具有特异性强，敏感高，较好的相关性和稳定性，能够用于猪场疫苗免疫前后抗体水平，对PRRSV的防控具有重要意义。
李雪平，高级兽医师，执业兽医师。广州悦洋生物技术有限公司副总经理，2005年毕业于华中农业大学动物医学院，2008年在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所取得预防兽医硕士学位，后一直从事于动物疫病的监测服务工作，具有十多年诊断试剂相关的工作经验，在兽医诊断领域发表多篇科研论文。参先后获得广东省农业技术推广二等奖2项、湖北省科技进步二等奖1项，主导多项发明专利授权和新兽药注册证书的成功申报。先后去韩国生物科学和生物技术研究所、泰国朱拉隆宫大学进行学术交流。
来源： 《猪业》、养猪信息网
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