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摘要：为了解广西玉林市规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染情况及其与猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪伪狂犬病病毒（PRV）混合感染情况，采用RT-PCR/PCR方法，对2016—2018年采集自玉林市存栏母猪300头以上规模化猪场的661份临床健康猪血清样本和896份表现呼吸道症状和繁殖障碍发病猪只的组织样本，进行PRRSV病原检测，并对检出的PRRSV病原阳性样本进行CSFV、PCV2、PRV病原检测，并对结果进行统计分析。结果显示：2016—2018年收集的血清样本中，PRRSV病原阳性率分别为6.86%、19.33%和10.17%，场阳性率分别为25.00%、46.67%和40.00%；PRRSV血清阳性样本混合感染率分别为52.38%、65.22%和62.50%，以与PCV2、PRV混合感染为主。2016—2018年收集的病料组织样本中，PRRSV病原检出率分别为46.38%、48.24%和48.81%，场阳性率分别为42.11%、35.37%、37.10%；PRRSV病料阳性样本混合感染率分别为50.00%、52.99%和52.35%，同样以与PCV2、PRV混合感染为主。结果表明，广西玉林市规模猪场中PRRSV流行广泛且呈加重趋势，与PCV2和PRV等病原的混合感染较严重。结果提示，玉林市规模猪场应制定科学的免疫程序，加强这些疫病的综合防控。
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的重要猪传染病之一，主要表现为不同年龄段猪只的呼吸道综合征、发热、出血，以及母猪流产和产弱仔、死胎或木乃伊胎为特征的繁殖障碍。我国大陆地区1996年首次报道此病并分离到病毒。2006年暴发的高致病性PRRS疫情给我国养猪业造成了巨大经济损失。由于PRRSV会破坏动物机体的免疫系统，从而造成免疫抑制，破坏或影响其他疫苗的免疫应答，继而增加其他疾病的感染风险。所以，临床上PRRSV常与其他病毒和细菌发生混合感染。黎军等报道2015—2019年广西14个地市不同规模类型猪场PRRSV、猪瘟病毒（CSFV）、圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）的多重混合感染现象较为普遍。李明波等对PRRSV和细菌混合感染的调查发现，猪群感染PRRSV后，易继发链球菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌等的混合感染。广西是我国生猪主产区之一，其中玉林市的生猪总产量位列广西首位。近年来，随着玉林市养猪场的规模化、集约化发展，猪群饲养密度日益增大，造成部分地区出现PRRS等多种猪病流行，对养猪业的危害日趋严重。因此，为了解广西玉林市猪群中的PRRSV流行情况和与其他病原的混合感染情况，对2016—2018年采集的临床健康猪群血清样本以及表现呼吸道症状和繁殖障碍的发病猪组织样本进行PRRSV病原检测，并对PRRSV阳性样本进行CSFV、PCV2和PRV的混合感染检测，旨在为此类疫病的有效防控提供数据支持。
材料与方法
血清样本
2016—2018年，从玉林市7个县（市、区）选择母猪存栏300头以上规模化猪场的临床健康猪群为目标群，根据各县（市、区）目标群数量，按比例确定研究猪场数量后，采集各猪场母猪、保育猪或育肥猪血清样品共计661份，其中2016年32个场、306份血样，2017年15个场、119份血样，2018年20个场、236份血样（表1）。
组织病料
2016—2018年，共收集玉林市7个县（市、区）规模猪场送检的896份发病猪（包含死猪）病料，包括流产胎儿或死胎，以及有呼吸困难、发烧、皮肤发红、腹泻等临床症状的哺乳仔猪、保育猪、育肥猪和母猪的组织病料，其中2016年57个场次、235份，2017年82个场次、284份，2018年124个场次、377份（表2）。
病毒DNA/RNA提取
血清样本。抽取200μL血清，按照TGuide S32 磁珠法病毒DNA/RNA抽提试剂盒说明书提取DNA/RNA，将所获得的DNA/RNA直接进行PCR/RT-PCR检测或置于-70℃保存。
组织病料。按1:5质量比，加入生理盐水，在组织研磨仪内研磨，反复冻融3次，4℃条件下，10000r/min 离心5min，取上清抽提DNA/RNA或保存于-70℃冰箱备用。按照TGuide S32 磁珠法病毒DNA/RNA抽提试剂盒说明书提取DNA/RNA，然后将所获得的DNA/RNA直接进行PCR/RT-PCR或置于-70℃保存。
引物设计与合成
根据GenBank中公开发表的PRRSV、CSFV、PCV2和PRV基因序列，利用Meg Align（DNAstar）和Primer Premier 7.0软件设计引物。引物信息详见表3。
PRRSV检测
利用特异性引物，对提取的样品RNA进行一步法RT-PCR扩增。反应结束后，取10μL PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
其他病原检测
将检出的PRRSV阳性样本进行CSFV、PCV2和PRV病原检测，并统计PRRSV阳性样本中，上述3种病原的混合感染情况。其中：CSFV的RT-PCR检测方法同1.6；PCV2、PRV的PCR检测，采用特异性引物，对提取的样品DNA进行PCR扩增。反应结束后，取10μL PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
结果与分析
血清样本的PRRSV检测
结果（表4）显示：2016—2018年广西玉林市规模猪场PRRSV血清样本阳性率分别为6.86%、19.33%和10.17%，猪场阳性率分别为25.00%、46.67%和40.00%，整体呈上升趋势；3年内玉林市7个县（市、区）均有PRRSV阳性样本被检出，说明PRRSV流行广泛。
血清样本的混合感染检测
对68份PRRSV阳性血清样品进行了CSFV、PCV2和PRV病原检测。结果（表5）显示，2016—2018年PRRSV阳性血清样本的混合感染率分别为52.38%（11/21）、65.22%（14/23）、62.50%（15/24），其中与PCV2的混合感染率最高，其次是与PRV。
病料样本的PRRSV检测
对采集的流产胎、死胎以及不同猪群发病组织样本进行了PRRSV病原检测。结果（表6）显示，2016—2018年病料组织样本的PRRSV检出率分别为46.38%、48.24%、48.81%，场阳性检出率分别为42.11%、35.37%、37.10%，平均样本阳性检出率和场阳性检出率分别为48.00%和37.64%。母猪、保育猪以及流产胎、死胎样本的PRRSV检出率较高，分别为58.82%、52.66%和50.23%；母猪和育肥猪的场PRRSV检出率较高，分别为43.48%和46.67%（表7）。
病料样本的混合感染检测
对病料样本中检出的430份PRRSV阳性样本进行了CSFV、PCV2和PRV病原检测，结果发现，2016—2018年PRRSV阳性样本的混合感染率分别为50.00%、52.99%、52.35%，其中与PCV2的混合感染率最高，分别为45.28%、49.25%、49.41%，其次是与PRV的混合感染，分别为14.15%、14.93%、14.12%（表8）。
对不同PRRSV阳性病料的混合感染情况进行统计发现，流产胎/死胎和哺乳仔猪的混合感染率较低，PRRSV单一感染率较高，而随着日龄增长，保育猪和育肥猪的混合感染率依次升高，分别为58.17%和64.71%。
讨论
本研究对广西玉林市规模化猪场健康猪群的血清样本和病料组织样本进行了PRRSV病原检测，发现血清样本平均阳性率为10.29%，且呈上升趋势，而病料组织样本阳性检出率一直维持在48.00%的较高水平。毕峻龙对2013—2018年云南不同地区规模猪场收集的2234份样品进行PRRSV病原检测，发现2016—2018年的检出率分别为21.08%、33.06%和41.72%，也呈上升趋势，与本研究结果一致，说明PRRS流行依然较严重，仍是当前对我国生猪养殖业危害最严重的猪病之一。规模猪场PRRSV感染有加重趋势，有可能与2017年PRRS退出国家强制免疫政策后，猪场防控意识减弱有关。为节约成本，部分猪场减少了PRRSV疫苗的免疫次数和用量，但又缺乏完备的保障措施。
本研究发现，玉林市规模猪场PRRSV与其他病原的混合感染较为严重，最为常见的是PRRSV与PCV2的混合感染，其次是与PRV。这与刘晓东、Ouyang和Chen等研究发现的我国部分地区规模猪场中PRRSV与PCV2混合感染比例最高，其次是PRV的研究结果相似。PRRSV通过呼吸道或生殖道侵入猪体内，在猪肺泡巨噬细胞（PAM）内大量增殖，从而使其失去抗原递呈和吞噬清除功能，并且以PAM为载体转移到全身，使机体非特异免疫功能急剧下降，因此增加了猪体继发其他病毒或细菌感染的概率，导致疾病的临床症状变得更为复杂。PCV2也是一种主要通过侵害机体单核细胞及巨噬细胞等免疫细胞，造成机体免疫抑制的病原。有研究表明，PCV2与PRRSV的感染有协同作用，当猪体感染PRRSV时引发了PAM的凋亡和崩解，摧毁了肺部的初级防疫，此时PCV2可以借助低水平的感染，逃避宿主免疫反应机制而不被识别，然后进一步感染PAM细胞并大量繁殖，并且联合导致病猪临床症状加剧，其严重程度与其体内两种病毒载量的水平呈正相关。
本研究发现，流产胎/死胎、哺乳仔猪中PRRSV与其他病原的混合感染率较低，而保育猪和育肥猪群的混合感染率依次增高。这与李记蕾等对从河南省送检的猪血清进行检测，得到妊娠母猪阳性率为70%、哺乳仔猪阳性率为55.00%、保育猪阳性率为47.00%、育肥猪阳性率为74.00%的结果相似。这说明PRRSV对各生长阶段猪群均有危害，既可以通过呼吸道在猪群中水平传播，也能通过母猪胎盘屏障进行垂直传播，是造成猪场发病率和病死率上升的主要因素之一。同时，随着日龄的增加，保育阶段猪只的母源抗体下降到达临界值，而自身抗体还未产生，同时感染其他病原的机会也在增多，所以保育猪和育肥猪群的多种病原混合感染率逐渐增高。
由于规模猪场采集组织样品的可操作性受限制，本次研究中血清样本的采样场点和样本量有限，研究结果可能和玉林市规模猪场中PRRSV、PCV和PRV的实际感染率有一定的误差，但临床表现健康的猪血清样本中所检测到的上述病原的阳性率结果，仍能说明近年来玉林市部分规模化猪场存在PRRSV、PCV2和PRV的隐性混合感染情况，应据此制定相应的免疫程序，采取相关措施加强防控。
结论
研究发现：广西玉林市规模化猪场中PRRSV流行广泛，且有加重趋势；同时存在一定的隐性带毒风险，且与PCV2和PRV等病原的混合感染较严重。因此，玉林市规模猪场应制定科学的免疫程序，采取综合措施，加强这些疫病的防控。
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