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摘要：为掌握我国I类新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的分布及分子演化特征，2016—2019年，随机从国内23个省（自治区、直辖市）998个采样点，采集家禽口咽/泄殖腔双拭子样本、野鸟粪便样本和环境样本共45 458份，通过病毒分离和RT-PCR鉴定，共分离到I类NDV 558株。从时间分布看，2016—2019年I类NDV分离率分别为0.95%、0.89%、1.88%和1.37%，有增高趋势；从地理分布看，我国16个省（自治区、直辖市）分离到I类NDV，主要集中于华东、西南和西北地区；从场点分布看，活禽批发市场和农贸市场的I类NDV阳性率明显高于养殖场和屠宰场；从宿主分布看，I类NDV主要来源于鸡和鸭，少量来自鹅、鸽和环境样本；从基因型分布看，558株I类NDV属于2个基因亚型，其中1.1.2亚型为近年来我国流行的主要基因亚型。研究表明，我国I类NDV污染面广，宿主范围广泛，且存在2种基因亚型。研究提示，应加强I类NDV的免疫、监测，同时加强饲养管理，提高家禽抵抗力，降低病毒基因变异致毒力增强的风险。本研究为我国科学防控新城疫提供了参考数据。
新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）正禽腮腺炎病毒属（Orthoavulavirus），为单股负链RNA病毒，可感染240多种禽类。NDV只有1个血清型，但可分为多种基因型。根据病毒F基因序列差异，毒株可分为I类（class I）和II类（class II）两大类。II类NDV流行时间较长，至少包括21种基因型。历史上引起5次ND大流行的毒株和常用疫苗株均属于II类NDV。I类NDV只有1个基因型，但可细分为3个基因亚型。2003年I类NDV在法国野生麻鸭中被首次分离到，此后又出现于野生水禽和野鸟中，近年来又传播至家禽。2008年通过病毒分离，我国首次证实I类NDV的存在，随后研究发现病毒已在我国广泛流行。回顾性调查发现，2002年在浙江、福建等地活禽市场检出的病毒与其同类，说明I类NDV早已存在。虽然I类NDV绝大多数为无毒株或弱毒株，但已有学者证实NDV弱毒株可通过鸡或鸡胚连续传代增强毒力。我国养禽业发达，I类NDV污染面广且存在基因变异和毒力增强的风险。因此，对国内家禽中携带的I类NDV进行长期系统监测，掌握病毒分布和流行规律，对新城疫防控具有重要意义。本研究于2016—2019年，按照《国家动物疫病监测与流行病学调查计划》，在我国23个省（自治区、直辖市）998个采样点，随机采集家禽口咽/泄殖腔双拭子样本、野鸟粪便样本和环境样本，通过病毒分离和常规RT-PCR技术检测I类NDV，并对分离株进行遗传进化分析，以期为科学防控新城疫提供参考数据。
材料与方法
样本与鸡胚
从国内23个省（自治区、直辖市）的批发市场、农贸市场、养殖场和屠宰场，随机采集不同种类家禽的口咽/泄殖腔双拭子样品和环境样品，并在野鸟栖息地采集野鸟粪便样品。
病毒分离鉴定
按照国标《新城疫诊断技术》（GB16550—2008）规定方法，将采集的样品接种9~11日龄SPF鸡胚。每个样品接种2枚鸡胚，37℃孵育，弃掉24h内死胚；96h后，收获鸡胚尿囊液，进行血凝（HA）、血凝抑制（HI）试验；分装鉴定为NDV阳性的尿囊液，-80℃保存。
RNA提取
采用High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取病毒RNA，将提取的RNA立即用于RT-PCR扩增或者于-20℃保存。
RT-PCR鉴定
采用本实验室建立的RT-PCR方法，利用Hiscript High Fidelity One Step RT-PCR Kit（Vazyme）扩增病毒F基因。引物序列见表1。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
遗传进化分析
利用MEGA 6软件，对毒株F基因序列进行系统进化分析；采用邻位相连法（neighbor-joining）构建系统进化树。
结果
I类NDV监测
2016—2019年，按照《国家动物疫病监测与流行病学调查计划》，在安徽、江苏、上海等23个省（自治区、直辖市）开展了新城疫病原学主动监测，在998个采样点共采集家禽口咽/泄殖腔拭子、野鸟粪便样本和环境样本45458份，经病毒分离、RT-PCR鉴定和序列测定，共分离到I类NDV 558株，病毒阳性率为1.23%（95%CI，1.13%~1.33%）。其中，2018年I类NDV阳性率最高，为1.88%（表2）。558株病毒主要来源于鸡（403株）和鸭（126株），少量来自鹅、鸽和环境样本（表3）。野鸟粪便样本中未检测到病毒。
2016—2019年分离的558株I类NDV来源于安徽、福建、广东、广西、贵州、湖北、江苏、江西、宁夏、上海、四川、云南、西藏、青海、新疆和浙江等16个省（自治区、直辖市）的127个采样点，主要分布于我国华东、西南和西北地区，其中，广东、广西、江苏、江西、宁夏、上海、云南等地连续4年分离到I类NDV。监测到I类NDV的127个采样点包括，31个活禽批发市场、91个农贸市场、3个养殖场和2个屠宰场。活禽批发市场和农贸市场年均病毒阳性率分别为28.70%和24.33%（图1），明显高于养殖场和屠宰场（P＜0.05）。
I类NDV遗传进化分析
遗传进化分析结果（图2）显示：2016—2019年分离的558株I类NDV分属于2种基因亚型：1.1.2亚型551株、1.2亚型7株。其中，1.1.2亚型为目前我国家禽中流行的优势基因亚型，在我国16个省（自治区、直辖市）家禽中均分离到；1.2基因亚型均为鸭源分离株，分别于2016年和2018年分离自宁夏、江苏和广西等地。
讨论
1926年3月，印度尼西亚在爪哇岛首次发现新城疫，随后英格兰、朝鲜、印度、斯里兰卡、菲律宾、日本和澳大利亚等国也相继报道发生新城疫。迄今为止，该病已蔓延至世界各地，给养禽业造成严重危害。毒株遗传进化分析结果显示，NDV可分为I类、II类两大类。I类NDV出现较晚，2003年首次在法国野生麻鸭中分离到，早期主要存在于野生水禽和野鸟中，随后在活禽市场家禽中被陆续分离到。早期基因分型方法将I类NDV分为至少10个基因型，国内流行毒株主要为基因2型和3型。2012年，Diel等将I类NDV合并为1个基因型，但细分为3个基因亚型（1a、1b和1c）。我国流行毒株主要为基因1b亚型。2019年，全球9家OIE新城疫参考实验室联合20家国际著名实验室更新了NDV分类方法，将I类NDV划分为1个基因型3个基因亚型（1.1.1、1.1.2和1.2）。我国早期分离株属于1.1.1和1.2基因亚型。2016—2019年我国分离的I类NDV主要为1.1.2基因亚型，只有7株病毒属于1.2基因亚型。序列分析结果显示，2016年我国宁夏和江苏分离的6株1.2基因亚型毒株与北美野生水鸟分离株高度同源。此类病毒于2015年首次出现于我国广西鸭群，但由于缺乏周边国家新城疫监测数据，至今仍不清楚该毒株的确切来源。
我国I类NDV污染面广。2016—2019年我国16个省（自治区、直辖市）127个采样点均分离到I类NDV。2011—2015年监测数据表明，I类NDV主要分布于我国华东、华中、华南和西南等东部和南部地区。本研究结果显示，近年来I类NDV主要分离自我国华东、西南和西北地区，暗示病毒正逐渐从我国东部和南部向西部蔓延。活禽批发市场和农贸市场是I类NDV的高污染场点。本研究在活禽市场的鸡、鸭、鹅、鸽等家禽和环境样本中均分离到I类NDV。部分活禽市场中，家禽免疫情况不明，多种禽类混养，市场卫生条件较差，这些因素极易导致病毒传播。因此，应加强活禽市场的生物安全管理，积极采取消毒、休市等措施。2017—2018年，本研究在少数养殖场中也分离到I类NDV。I类NDV虽为弱毒株，使感染鸡不表现明显临床症状，但在鸡体内连续传代后，可能通过基因变异增强毒力。因此，在家禽饲养过程中，应制定科学的免疫程序，做好疫苗免疫和抗体监测，同时加强饲养管理，改善养殖环境，提高家禽抵抗力，降低病毒感染、变异和传播的风险。
结论
本研究发现，我国I类NDV污染面广，宿主范围广泛，且存在2种基因亚型。建议加强饲养家禽I类NDV的免疫、监测，同时加强饲养管理，提高家禽抵抗力，降低病毒基因变异使毒力增强的风险。
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