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摘要：为了解广西柳州市活禽市场低致病性禽流感病毒的流行及分布情况，2015年6月—2019年5月持续在柳州市8个活禽市场采集鸡鸭喉头/泄殖腔棉拭子样品1 425份（麻花鸡500份、麻鸭925份），通过SPF鸡胚培养，采用HA和HI试验进行鉴定，并对结果进行统计分析。结果显示：共检出阳性样品156份，阳性率为10.95%（156/1 425）；分离出6种亚型，阳性率从高到低依次为H3、H4、H9、H6、H11和H13，其中H13亚型为广西地区首次报道发现，样品来源于麻鸭；从种属分布和混合感染情况来看，鸭群中6种亚型均有感染，但以H3、H4亚型为主，主要表现为混合感染，而鸡群中只有4种亚型，以H9亚型为主。结果表明，柳州市活禽交易市场低致病性禽流感病毒亚型复杂，尤其是麻鸭，且有新亚型出现，病毒变异重组风险加剧，需要坚持活禽市场禽流感病毒长期监测。
禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）属于A型流感病毒，能引发禽类急性、烈性传染病。AIV具有亚型多态性特点，目前已在家禽和野生鸟类中发现16种HA和9种NA抗原亚型。HA基因和NA基因可以随机组合产生不同亚型病毒，多数为低致病性病毒（LPAIV），少量为高致病性病毒（HPAIV）。目前只发现H5和H7这两种HA基因亚型病毒属于高致病性。AIV变异性大，LPAIV可通过基因重组和基因突变（抗原漂移和抗原转变）等转变为HPAIV。此外，AIV可以跨种属屏障，感染人。
活禽市场作为禽类交易的场所，活禽流动性大、交易品种繁多，又普遍缺乏严格的消毒和隔离措施，这给AIV传播带来便利，同时活禽市场也是人群和各类禽类集结接触的主要场所，因此加强LPAIV长期监测，掌握其流行趋势，对指导市场管理，加强禽流感防控都具有重要意义。为此，2015年6月—2019年5月对柳州市辖区的活禽市场连续进行LPAIV监测，以期了解其感染率、亚型分布、混合感染情况，以便为制定禽流感防控措施提供参考。
材料与方法
鸡胚与红细胞
9~11日龄SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物有限公司；1% SPF鸡红细胞，由广西兽医研究所禽病室按照《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936—2003）配制。
样品采集
在柳州市8个活禽市场（市区2个、县区6个）按月轮流采样，每个市场随机选择5个摊位/商户，每个摊位/商户原则采集3份麻花鸡、5份麻鸭棉拭子样品（根据每个摊位实际鸡鸭数稍有调整）。2015年6月—2019年5月，共在柳州市8个活禽市场40个摊位/商户，采集喉头/泄殖腔棉拭子样品1 425份，其中鸡源500份、鸭源925份。采集后放入2 mL离心管（含1 mL双抗的PBS，棉拭子头折断放入）中冷藏运输至实验室，-70 ℃保存。
病毒分离和亚型鉴定
清洗棉拭子，离心，取0.25 mL上清液经尿囊腔接种9~11日胚龄的SPF鸡胚，每个样品接种2枚胚，37 ℃孵化；收集24~96 h死亡或存活的鸡胚尿囊液，测定HA效价，再对HA阳性样品测定HI效价，具体方法参照文献。
结果与分析
亚型分布
在采集的1 425份喉头/泄殖腔棉拭子样品中，检出阳性样品156份，总阳性率为10.95%；共检出6种亚型，各亚型阳性率从高到低依次H3、H4、H9、H6、H11和H13，阳性率介于0.07%~4.00%（表1）。
群间分布
采集鸡喉头/泄殖腔棉拭子500份，检出阳性27份，阳性率为5.40%；采集鸭喉头/泄殖腔棉拭子925份，检出阳性129份，阳性率为13.95%，显著高于鸡（P＜0.05）。从鸭中共分离到6种HA亚型，阳性率从高到低依次为H3、H4、H9、H6、H11和H13；从鸡中分到4种HA亚型，阳性率从高到低依次为H9、H6、H3和H4。从分离结果（表2）可以看出，鸡主要以H9亚型感染为主，占鸡阳性样品的85.16%；鸭主要以H3、H4亚型感染为主，占鸭阳性样品的85.27%。
混合感染
在156份阳性样品中，检出混合感染样品31份，混合感染占比19.87%，主要是H3、H4、H6、H9这4种亚型的混合感染。其中：2种亚型混合感染29份，占比最高（93.55%），分别是H3+H4（25份）、H3+H9（2份）、H3+H11（1份）、H4+H6（1份），全部为鸭样品；3种亚型混合感染2份（鸡、鸭各1份），混合感染类型均为H3+H4+H9。从结果可以看出，混合感染以H3和H4亚型为主，主要存在于鸭群。
讨论
我国南方地区人们喜欢吃鲜活禽，这是活禽销售的主要推动力，使得人与活禽的接触频率很高。一般活禽交易市场里的商户同时销售多种活禽，其来源又不同，这些都给AIV重配提供了便利条件。活禽市场在AIV流行、进化及感染人方面起重要作用。柳州市近几年也曾发生过人H5N1和H7N9流感事件，感染者都有活禽接触史。因此，加强活禽市场的LPAIV监测具有重要意义。
近年来，广西兽医研究所调查发现，广西家禽和野鸟携带的LPAIV共有7种亚型（H1、H3、H4、H6、H9、H10、H11）。本研究发现，柳州市活禽市场鸡样品中的LPAIV阳性率为5.40%，鸭样品为13.95%，鸭阳性率明显高于鸡，这与其他学者的研究调查情况基本一致。本次调查首次在家禽中分离到H13亚型LPAIV。该阳性样品来源于2018年11月某县区采集的麻鸭喉头/泄殖腔棉拭子。麻鸭以池塘养殖为主，属于半开放式养殖，可与外界鸟类密切接触。该县区位于柳州市北部，属于山林地区，野生鸟类出没频繁。H13亚型LPAIV的出现，推测可能来源于野生鸟类，这需要进一步研究确认，其是否对家禽有致病性以及基因是否存在变异等一系列问题也需要后续研究。本次监测共从家禽中分离出6种亚型的LPAIV，且首次检出H13亚型，说明广西家禽携带的LPAIV更加复杂多样。
抗原漂移和转变是AIV由低致病性转变为高致病性的重要机制。在自然条件下不同基因型病毒的高频率混合感染，容易使病毒在同一感染细胞内发生基因重组，导致抗原转变。2013年感染人的H7N9流感病毒就是由野鸟的H7和N9亚型（表面基因）在鸡体内与家禽中的H9N2亚型内部基因重组而形成的，由对鸡无致病性突变为严重危害家禽健康的高致病性病毒。本研究表明，鸡鸭都存在不同程度的LPAIV混合感染，但是在鸭中更为普遍。这为病毒变异提供了较好的载体。值得注意的是，H4亚型病毒已具备跨种感染哺乳动物的能力，提示其对公共安全有潜在威胁。因此，加强活禽市场LPAIV的长期监测，准确掌握该病毒的流行特点，可为该病的预防和控制提供有效的流行病学资料，同时对保障公共卫生安全也具有重要意义。
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