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摘要：为探究猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在规模猪场的流行特征，2021年从湖北省7个规模猪场疑似PRRSV感染猪群以及所有种公猪群中，共收集样品3 324份，采用三重巢式RT-PCR法进行PRRSV病原学检测，分析不同养殖类型、不同生长阶段、不同季节及不同感染毒株的流行特点，并将阳性产物进行测序和遗传进化分析。结果显示：3 324份样品中共检测出PRRSV阳性样品323份，阳性检出率为9.72%（323/3 324）。育种场阳性检出率最低，为2.66%（20/752）；商品猪扩繁场与育肥场阳性检出率相近，分别为11.82%（169/1 430）与11.73%（134/1 142）；保育猪群阳性检出率最高，为17.23%（152/882）；其余依次为生长育肥猪、哺乳仔猪和母猪，阳性检出率分别为11.30%（121/1 071）、5.26%（30/570）和3.24%（20/618）；种公猪中未发现PRRSV感染。PRRSV一年四季均可流行，春、夏、秋、冬季的阳性检出率分别为18.16%（148/815）、6.94%（60/864）、6.10%（34/557）、7.44%（81/1 088），春季阳性检出率显著高于其他季节（P＜0.05），而夏、秋、冬季节间差异不显著（P≥0.05）。3种PRRSV毒株均有流行，类NADC30毒株、经典毒株和高致病性变异毒株的占比分别为49.54%、21.36%、29.10%，类NADC30毒株检出占比显著高于其他类型毒株（P＜0.05）。结果表明：PRRSV在所调查的7个规模猪场中流行普遍，尤其是商品猪扩繁场与育肥场；保育猪群PRRSV感染风险较高，种公猪感染风险较低，春季是高发季节，类NADC30毒株为优势流行毒株。结果提示，规模养殖场应根据PRRSV的流行特征，加强免疫和监测，有针对性地制定防控措施。
猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一种以繁殖障碍和呼吸系统症状为特征的接触性猪病毒传染病，是制约生猪养殖业发展的重要疾病之一。其病原体猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）是动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。研究表明：各生长阶段猪只均易感染PRRSV，传播途径主要有水平传播和垂直传播，其中水平传播包括与患病猪接触、空气传播以及精液传播等，垂直传播主要经胎盘传播。目前在国内流行的PRRSV按致病力不同，大致可以分为经典毒株、高致病性变异毒株和类NADC30毒株。1995年国内首次发现疑似PRRS猪，1996年从猪阳性血清中成功分离出PRRSV，从而证实了国内有PRRS流行。1995—2006年，PRRS表现经典临床症状，以经典毒株（CH1a毒株）流行为主。经典毒株主要导致母猪繁殖障碍、仔猪呼吸系统疾病，以及育肥猪呼吸道疾病、 生长发育缓慢，还会出现继发性疾病，导致哺乳猪、保育猪死亡率上升。母猪群暴发的经典PRRS，一般会在一个半月内趋于稳定，但潜伏期较长。而高致病性PRRS从2006年开始在我国流行，其病原是毒力更强的PRRSV变异株（JXA1毒株），相比较于经典毒株，高致病性变异毒株致病力更强，传播速度更快，除了引起经典毒株的症状外，对神经系统、免疫系统、消化系统也有较强的致病性，仔猪发病率甚至可高达100%，死亡率达50%，母猪流产率超过30%，给国内大部分地区的规模化猪养殖场造成了重大经济损失。从2012年开始，陆续有PRRSV新毒株在国内出现的报道，其与NADC30毒株同源关系较近，因此将这类病毒统称为类NADC30毒株，但不同NADC30毒株之间的致病力呈现出一定的差异。近年来有相关文献报道，类NADC30毒株与其他毒株发生了重组变异，使PRRSV基因型更加复杂，这给我国PRRS防控带来了更大挑战。
为探究PRRSV在规模猪场的流行特征，2021年从湖北省7个规模猪场疑似感染PRRSV猪群以及所有种公猪群中收集样品进行病原学检测，并从养殖类型、生长阶段、季节及感染毒株等方面进行统计分析，以期为今后的PRRS防控提供依据。
材料和方法
病料采集
2021年，从湖北省7个规模化养殖场（1个存栏1 000~2 000头的核心育种场、1个存栏＞5 000头的商品猪扩繁场和5个存栏＞5 000头的育肥场），对临床上出现呼吸和繁殖障碍症状以及耳朵发紫和有繁殖障碍史的猪群进行采样检测，对核心育种场的种公猪进行普检，共采集3 324份临床样品。将样品置于冰上运输至实验室，并于24 h内完成后续检测。
样品预处理及病毒RNA提取
样品预处理方法参照相关文献，预处理样品用于后续病毒RNA提取。样品病毒RNA提取，采用Axygen体液病毒核酸提取试剂盒，具体步骤参照试剂盒说明书进行。用Nanodrop 1 000检测所提取RNA的浓度和纯度，将RNA于-20 ℃保存备用。
病原学检测
采用三重巢式RT-PCR法，对样品进行PRRSV病原学检测（此方法可同时检测经典毒株、高致病性变异毒株和类NADC30毒株）。引物序列如表1所示。
数据统计与分析
对不同类型养殖场、不同年龄段、不同季节及混合感染的检测结果，采用SPSS 24.0卡方检验进行差异性分析，P≥0.05为差异不显著，P＜0.05为差异显著。通过Origin 2019软件，对检测样品的PRRSV阳性检出率进行处理分析。从检测出的不同毒株阳性产物中各随机选取3份（共9份阳性产物），送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序；将测序序列通过NCBI进行BLAST比对，并利用MEGA7.0软件中Neighbor Joining法，绘制系统发育进化树。
结果与分析
不同养殖类型
不同类型养殖场检测结果（表2）显示：共检出PRRSV阳性样品数323份，平均阳性检出率为9.72%（323/3 324），其中核心育种场阳性检出率为2.66%（20/752），商品猪扩繁场为11.82%（169/1 430），育肥场为11.73%（134/1 142）；核心育种场阳性检出率显著低于扩繁场和育肥场（P＜0.05），而商品猪扩繁场与育肥场阳性检出率差异不显著（P≥0.05）。结果表明，与商品猪扩繁场和育肥场相比，核心育种场PRRSV感染程度较轻。
不同生长阶段
不同生长阶段猪群检测结果（表3）显示：种公猪未检出阳性，阳性检出率为0（0/183），母猪阳性检出率为3.24%（20/618），哺乳仔猪为5.26%（30/570），保育猪为17.23%（152/882），生长育肥猪为11.30%（121/1 071）；不同生长阶段猪群的PRRSV阳性检出率差异显著（P＜0.05）。结果表明，不同生长阶段猪群的PRRSV感染程度差异较大，保育猪感染最严重，其余依次是生长育肥猪、哺乳仔猪和母猪，而种公猪经普检未发现感染。
不同季节
不同季节猪群检测结果（表4）显示：春季（3—5月）的PRRSV阳性检出率为18.16%（148/815），夏季（6—8月）为6.94%（60/864），秋季（9—11月）为6.10%（34/557），冬季（12月—次年2月）为7.44%（81/1 088），春季阳性检出率显著高于其他季节（P＜0.05），而夏秋冬三季间的阳性检出率差异不显著（P≥0.05）。结果表明，春季是PRRSV感染的高峰期，夏秋两季猪群感染程度明显下降，冬季开始反弹。
不同毒株
阳性样品中不同PRRSV毒株检出结果（表5）显示：323份PRRSV阳性样品中，类NADC30毒株检出占比最高，为49.54%（160/323），其余依次是高致病性变异毒株（29.10%，94/323）、经典毒株（21.36%，69/323），未发现多重毒株混合感染情况。类NADC30毒株检出占比显著高于其他毒株（P＜0.05），而高致病性变异毒株与经典毒株检出占比差异不显著（P≥0.05）。
选取9份阳性产物测序并建立系统发育进化树。结果（图1）显示：9条序列分别属于PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株与类NADC30毒株，其中3条序列（HB-01、HB-02及HB-05）与以VR2332为代表的经典毒株属于同一进化分支，3条序列（HB-03、HB-08及HB-09）与以JXA1为代表的高致病性变异毒株属于同一进化分支，剩余3条序列（HB-04、HB-06及HB-07）与以NADC30为代表的类NADC30毒株属于同一进化分支。
讨论
本研究对2021年湖北省7个规模猪场的PRRSV感染情况进行调查，发现平均阳性检出率为9.72%（323/3 324）。赵永祥2013—2014年对四川省部分地区进行PRRSV流行病学调查，发现平均阳性率为38.76%（69/178）；刘晓东2015—2017年对国内部分地区进行PRRSV流行病学调查，发现平均阳性率为31.84%（1138/3 574）；李焱2018—2020年对山东省进行PRRSV流行病学调查，发现平均阳性率为16.57%（355/2 143）。从上述调查结果可以看出，2018年后国内PRRSV的感染程度呈下降趋势，与本研究以及牛婷婷等的研究结果一致。这可能是自2018年非洲猪瘟在国内暴发以来，国内许多规模猪场配套了更完善的生物安全体系，加上全国限制跨区域调猪，这些措施对PRRS防控也有积极成效。
不同养殖类型调查结果显示，核心育种场感染程度（2.66%）低于扩繁场（11.82%）和育肥场（11.73%），差异显著（P＜0.05）。核心育种场配备了更严格的生物安全制度，饲养管理水平更高，且是自繁自养体系，杜绝了外来携带病毒猪只的进入；PRRSV也是核心育种场选育体系的净化病原之一，抗原阳性猪只会被优先淘汰。
不同生长阶段猪群调查结果显示，各生长阶段猪群的感染程度差异显著（P＜0.05），其中保育猪阳性检出率最高，其余依次是生长育肥猪、哺乳仔猪和母猪，而种公猪普检未发现PRRSV感染。保育猪阳性检出率最高的原因可能是，保育阶段处于母源抗体衰减和疫苗免疫的临界点。何海建等研究表明，随着日龄增加，仔猪体内的母源抗体水平逐渐降低，至42日龄时，仔猪体内基本检测不出PRRSV抗体。所调查的规模猪场大多使用PRRSV灭活苗，而灭活苗的免疫抗体产生期较长，同时由于个体差异的存在，部分保育猪只未能达到免疫全覆盖，因此免疫程序需根据抗体消长规律制定。再加上保育猪的内脏器官尚未发育成熟，自身免疫力低，在高饲养密度的环境下，易通过接触和空气传播造成大规模感染。保育猪是PRRSV感染的重点猪群，须作为重点防控对象实时监测PRRSV抗体消长规律，建立合理的免疫程序，同时提高饲养管理水平，降低保育猪的感染程度，这对各阶段猪只PRRS防控意义重大。
不同季节调查结果显示，PRRSV一年四季均可流行，但与夏季（6.94%）、秋季（6.10%）、冬季（7.44%）相比，春季（18.16%）是PRRSV感染的高峰期。出现该季节性差异特征可能是由于湖北省属于亚热带季风气候，夏秋季节干燥炎热的环境易使PRRSV失去感染性，而春冬季寒冷潮湿的环境则有利于其存活。在当前非洲猪瘟防控的压力下，国内许多猪场完善了生物安全制度，通过带猪消毒这一措施进行防控，在炎热的夏秋季节，带猪消毒会减少热应激对猪只的影响，而在寒冷的春冬季节，为了保持猪舍内的温度，极大减少了室内外空气的流通，此时带猪消毒加剧了猪舍环境的湿度，导致PRRSV更易通过环境传播。相较于冬季，春季的气温更加多变，冷热应激对猪只的影响更大，因此春季PRRSV的感染最为严重。因此，春季需要加强PRRS防控，在确保猪舍内温度的同时要保持猪舍内干燥。
阳性样品中不同毒株感染结果显示，类NADC30毒株检出占比（49.54%）高于高致病性变异毒株（29.10%）和经典毒株（21.36%），差异显著（P＜0.05），说明类NADC30毒株是所调查规模猪场的优势流行毒株。目前国内市场上的PRRSV商品化疫苗主要是基于经典毒株和高致病性变异毒株研制而成的，对类NADC30毒株的交叉保护力度不够。并且类NADC30毒株之间差异较大，变异速度快，易与其他毒株发生重组变异，使PRRSV基因型更加复杂，这给养殖场PRRS防控带来更大挑战。在PRRSV基因型复杂多变的情况下，需要实时监测毒株变异情况，分析出毒株的遗传进化规律，提前制定出相应的防控方案。
综上所述，要做好PRRS防控工作，需要采取综合防控策略：一要制定严格的生物安全条例，建立完善的生物安全体系；二要坚持自繁自养，确需引种，则需制定完善的引种制度，避免外来携带病毒猪只的进入；三要实时监测猪只PRRSV抗体水平及毒株的遗传进化规律，重点做好保育阶段猪只和春季时节的PRRS防控。
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