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摘要：为了解龙岩市水禽坦布苏病毒（ATV）感染情况及其NS5基因遗传变异情况，对采自福建省龙岩市7个县（市、区）农贸市场、规模化禽场和散养户的鸭泄殖腔棉拭子2 885份、鹅泄殖腔棉拭子样品320份进行ATV RT-PCR检测，并对部分阳性样品进行病毒分离鉴定及NS5基因序列测定与遗传进化分析。结果显示：ATV总阳性率为17.19%（551/3 205），其中鸭、鹅样品阳性率分别为16.81%（485/2 885）、20.63%（66/320），差异显著（P＜0.01）；按不同场所统计，散养户水禽样品ATV阳性率最高（20.68%，304/1 470），农贸市场次之（15.19%，224/1 475），规模化养殖场最低（8.85%，23/260），相互间差异显著（P＜0.01）；按被检水禽日龄统计，90~＜180日龄水禽样品阳性率最高（21.29%，397/1 865），180~＜380日龄次之（17.62%，74/420），30日龄内最低（4.44%，4/90）；春季水禽样品阳性率（22.74%，362/1 592）明显高于秋节（11.72%，189/1 613）。将部分ATV阳性样品经鸭胚分离培养，共分离出13株鸭源、鹅源ATV毒株。对这13株分离株NS5基因片段进行核苷酸序列分析发现，其同源性高达98.6%~100%，与国内ATV代表株核苷酸序列同源性介于96.5%~99.7%，且处于同一进化树分支，而与澳大利亚等国外分离株亲缘关系较远。结果表明，目前福建省龙岩市鸭、鹅等水禽中存在不同程度的ATV感染，流行毒株仍为国内当前流行毒株，未出现明显变异。本研究了解了该地区ATV的流行特点及基因遗传进化情况，为制定ATV感染防控措施提供了依据。
禽坦布苏病毒（avian Tembusu virus，ATV）属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）恩塔亚病毒群新成员。该属成员主要为虫媒病毒，其中包含严重威胁人类健康的病毒，如登革热病毒（dengue virus，DENV）、日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、圣路易脑炎病毒（St. Louis encephalitis virus，SLEV）以及西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）等。此外，根据传播途径不同，黄病毒属病毒还可分为蜱媒病毒（tick-borne viruses group）、蚊媒病毒（mosquito-borne viruses group）和未知媒介病毒（non-vector group）。2010年4月，我国苏、闽、浙等多地的种（蛋）鸭群发生了一种以“产蛋量骤降、卵泡出血”为主要特征的新发疫病，经研究证实引发病原为一种新的黄病毒——鸭坦布苏病毒（duck Tembusu virus，DTV）。DTV起初发生在种（蛋）鸭群中，随后在种（肉）鹅、种（肉）鸭、种（蛋）鸡、鸽子、麻雀以及发病鸭场周围蚊子中相继被检测或分离到。鉴于DTV感染宿主范围拓宽，黄瑜等将鸭坦布苏病毒病统一命名为禽坦布苏病毒病（avian Tembusu virus disease，ATVD）。
ATVD最早于2000年在马来西亚某肉鸡群中发生，患病鸡群主要表现为运动机能紊乱和生产性能下降，但未出现死亡。2010年以来，我国鸭群中的ATVD疫情迅速蔓延至全国大部分养禽场。郭晨等对2019年鸭源ATV福建分离株（FJ42）E基因进行遗传分析，推测该毒株可能由马来西亚鸡源病毒随候鸟迁徙传播至福建省后逐步演化而成。在已知的候鸟主要迁徙路线中，“东亚—澳大利亚”候鸟迁徙路线途经我国福建等东部沿海诸省，而闽西地区水禽种质资源丰富，饲养量大，因此定期开展闽西地区水禽ATV检测及其基因变异分析意义重大。
本研究对采自福建省龙岩市7个县（市、区）活禽交易市场、规模化禽场和散养户的3 205份鸭、鹅泄殖腔棉拭子，进行ATV病原检测及分离鉴定，并对部分分离毒株NS5基因进行序列测定和遗传进化分析，以期掌握闽西地区ATV的分子特征和遗传进化规律，为科学制定防控措施提供依据。
材料与方法
主要试验材料
EasyPure? Viral DNA/RNA Kit、EasyScript? One-Step RT-PCR SuperMix及2×Easy Taq PCR Super Mix，购自北京全式金生物技术（TransGen Biotech）股份有限公司；DL 2 000 DNA Marker，购自TaKaRa公司；PCR仪、电泳仪，为Bio-Rad公司产品；凝胶成像系统Gene Genius，为Syngene公司产品。
检测样品
2020年春季和秋季，分别采集福建省龙岩市辖区内7个县（市、区）农贸市场、规模化禽场和散养户的鸭泄殖腔棉拭子样品2 885份、鹅泄殖腔棉拭子样品320份（表1）。
引物设计与合成
参照《禽坦布苏病毒病诊断技术》（DB35/T 1593—2016）合成检测引物。ATV NS5基因片段扩增引物（ATV/330F：GAGTGAACTCATCATACC；ATV/330R：GATTTGATCAACATGTCGTCT）由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室设计，铂尚生物技术（上海）有限公司合成。
样品RT-PCR检测
按EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒操作说明，提取病毒核酸；参照《禽坦布苏病毒病诊断技术》（DB35/T 1593—2016）开展RT-PCR检测。
病毒分离培养
将部分经RT-PCR检出的ATV阳性样品无菌处理后，经尿囊腔接种11日龄鸭胚，收取1~7 d内死亡的鸭胚尿囊液（未死亡鸭胚于接种后7 d收毒），连续盲传2代后再次进行ATV检测，将阳性样品保存于-80 ℃备用。
NS5基因片段序列测定与分析
使用引物ATV 330F/ATV 330R扩增ATV分离毒株的NS5基因片段，参照EasyPure Viral DNA/RNA提取试剂盒说明，提取病毒核酸。获得的RNA样品按EasyScript One-Step PCR SuperMix试剂盒说明书进行RT-PCR扩增。PCR反应体系50.00 μL：2×Easy Taq PCR Super Mix 25.00 μL，ddH2O 17.50 μL，上下游引物各1.25 μL，DNA模板5.00 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸10 min，35个循环。将阳性扩增产物送福州铂尚生物技术（上海）有限公司测序，获得序列分别使用Lasergene、Editseq、MegAlign、MEGA5等软件分析，然后与GenBank中的ATV参考株进行分子变异比较。
结果
样品RT-PCR检测
不同宿主 2 885份鸭泄殖腔棉拭子样品中，共检测出ATV阳性样品485份，阳性率为16.81%，其中番鸭、半番鸭、山麻鸭和连城白鸭的阳性率分别为23.71%（188/793）、20.45%（117/572）、11.63%（121/1 040）和12.29%（59/480）；320份鹅泄殖腔棉拭子样品中，共检测出ATV阳性样品66份，阳性率为20.63%（66/320）。不同宿主样品检测结果见表2。不同宿主的ATV阳性率比较发现，鸭平均阳性率（16.81%）与鹅（20.63%）差异极显著（P＜0.01）。部分样品RT-PCR扩增结果见图1。
不同日龄 3 205份水禽泄殖腔棉拭子样品来源于1~380日龄的水禽，其中1~＜30日龄的ATV阳性率为4.44%（4/90），30~＜90日龄为9.16%（76/830），90~＜180日龄为21.29%（397/1 865），180~＜380日龄为17.62%（74/420）。不同日龄水禽样品ATV阳性率比较发现，90日龄以上水禽的ATV阳性率（20.61%）明显高于90日龄以下（8.70%），两者差异极显著（P＜0.01）。不同日龄水禽样品检测结果详见表3。
不同场所 3 205份水禽泄殖腔棉拭子样品来自规模化禽场、散养户、农贸市场，分别为260、1 470、1 475份。统计结果（表4）显示，规模化禽场、散养户和农贸市场的AIV阳性率分别为8.85%（23/260）、20.68%（304/1 470）和15.19%（224/1 475）。可见，散养户的ATV阳性率最高，农贸市场次之，规模化养殖场最低，不同场所水禽的ATV阳性率差异极显著（P＜0.01）。
不同季节 不同季节检测结果（表5）显示，春季ATV阳性率为22.74%（362/1 592），秋季为11.72%（189/1 613），春季ATV阳性率明显高于秋季（P＜0.01）。
病毒分离及NS5基因序列测定与分析
将部分ATV阳性样品经鸭胚分离培养，从中选择8株鸭源（ATV-FJZP31、FJSH54、FJLC117、FJWP133、FJXL146、FJXL165、FJCT228、FJYD248）、5株鹅源（ATV-FJZP77、FJCT92、FJYD173、FJXL182、FJWP193）毒株，进行NS5基因片段序列测定，将获得的NS5基因片段与GenBank数据库中的ATV NS5基因序列进行同源性比较。结果（图2）显示，13株水禽（鸭和鹅）源ATV分离株的NS5基因片段核苷酸序列同源性高达98.6%~100%。该13株分离毒株与国内ATV代表株的核苷酸序列同源性介于96.5%~99.7%，其中同源性最高的是与中国2020年分离株H（MT108702.1）和CHN-YC（MN966680.1）。
遗传进化分析结果（图3）显示：不同来源的NS5基因片段核苷酸序列出现两个大的分支，分离毒株与国内其他恩塔亚病毒群（Ntayavirus group）的ATV处于同一分支，而澳大利亚分离株N2（EU303233）、日本脑炎病毒群（Japanese encephalitis virus group）、西尼罗病毒（West Nile virus）（AF481864）、圣路易脑炎病毒（St. Louis encephalitis virus）（EU090146）及罗西奥病毒（Rocio virus）（A Y632542）则处于另一进化分支。
讨论
ATV天然宿主广泛，先后有从鸭、鸡、鹅、鸽子、麻雀和蚊子等宿主中检测或分离到该病毒的报道。ATV对鸭群危害最大，可感染种（蛋）鸭或肉鸭，涉及樱桃谷鸭、北京鸭、绍兴鸭等国内外大部分品种。龙岩市以山麻鸭、连城白鸭、番鸭和半番鸭等品种饲养为主。本研究分别于2020年春季和秋季采集该地区农贸市场、规模化禽场及散养户的鸭、鹅泄殖腔棉拭子进行检测，结果发现ATV总阳性率为17.19%，其中鹅阳性率（20.63%）高于鸭（16.81%）。结合所采样品来源水禽的流行病学数据和信息，发现来源鸭群的ATV灭活疫苗免疫率高于鹅群，由此推测鸭鹅间阳性率差异可能与ATV灭活疫苗免疫状况相关，也可能与鸭、鹅样品不均等，鹅样品相对较少有一定关系。
ATV可自然感染不同日龄的鸭群，在未开展疫苗免疫前，临床中以种（蛋）鸭感染率最高。Ti等通过人工感染不同日龄鹅发现，鹅日龄越小，ATV感染率越高。本研究发现，90~＜180日龄水禽样品的ATV阳性率最高（21.29%），30日龄内最低（4.44%），这与30日龄以内幼鸭的母源抗体保护有一定关系。结合样品来源信息可见，90日龄以上水禽以种（蛋）用为主，表明龙岩市的种（蛋）水禽ATV感染较严重，且免疫过ATV灭活疫苗的禽群依然存在ATV感染，这可能与疫苗的选择及其免疫程序相关。
ATV作为蚊虫传播的黄病毒，其传播途径包括空气传播、接触传播和垂直传播等。对不同场所样品的检测结果进行统计发现，散养户水禽样品ATV阳性率最高（20.68%），农贸市场次之（15.19%），规模化禽场最低（8.85%）。散养户ATV阳性率相对较高可能与其养殖硬件条件、生物安全管理措施相对薄弱有关。由此提示，适当改善养殖场环境并加强生物安全防控，如合理开展免疫、加强环境消毒、定期驱蚊等，对该病防控至关重要。
ATV作为单股正链RNA病毒，其核苷酸容易变异，继而可能导致氨基酸、抗原性和致病性发生改变。NS5蛋白是ATV最大的蛋白质，其核酸序列高度保守，在病毒基因组复制和免疫逃逸等方面发挥重要作用。对龙岩市13株不同水禽源ATV分离株NS5基因片段核苷酸序列分析发现，其同源性高达98.6%~100%，也验证了该地区不同水禽源ATV分离株NS5基因较为保守。该13株ATV分离毒株与国内代表株核苷酸序列同源性介于96.5%~99.7%，与来自中国2020年分离株H（MT108702.1）和CHN-YC（MN966680.1）同源性最高。遗传进化分析显示，本研究分离毒株与国内其他恩塔亚病毒群（Ntayavirus group）的ATV处于同一分支，而与澳大利亚等国外分离株亲缘关系较远。以上结果与刘友生等于ATVD发病早期（2010—2011年）对采集自我国沿海及周边9省的439份家禽疑似ATV感染样品检测及NS5基因测序分析得出的结果相似。由此说明，龙岩市不同水禽源ATV分离株仍为当前国内流行株，但其全基因组、致病性等是否发生改变，有待进一步深入研究确定。
总之，本研究对2020年采集自龙岩市不同季节、品种、日龄及养殖模式的水禽泄殖腔棉拭子样品进行ATV病原检测及NS5基因变异分析，掌握了该地区ATV的流行特点及基因遗传进化情况，为制定该病防控措施提供了依据。
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