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摘要：为了解我国鸽腺病毒（pigeon adenovirus，PiAdV）的流行现状及分子遗传特征，2021—2022年在江苏、河南、安徽、江西、福建、广东、广西、云南等8个省（自治区）41个活禽交易市场，采集鸽口咽/泄殖腔双拭子样品共462份，通过PCR进行PiAdV核酸检测，并对其六邻体蛋白（hexon）编码基因进行遗传进化分析。核酸检测结果显示：除未从江苏省检出阳性外，从其他7个省（自治区）的24个活禽交易市场中检出120份PiAdV病原学阳性样品，个体阳性率为25.97%（120/462），场点阳性率为58.54%（24/41）；遗传进化分析结果显示，从不同省份随机挑选的15份PiAdV病原学阳性样品均属于B种（PiAdV-B）分支，与同属于PiAdV-B中的varient B小分支核苷酸同源性为99.1%~100%，而与PiAdV-A分支亲缘关系较远。结果表明，我国市场交易鸽群PiAdV污染面较广，感染率较高，PiAdV-B分支为优势流行毒种。因此，需要加强鸽养殖场的饲养管理和活禽交易市场的卫生管理，加快开展PiAdV疫苗研发，以有效控制PiAdV流行。
腺病毒（adenoviruses）属于腺病毒科（Adenovirus），为无囊膜双股线性DNA病毒，呈球形，外壳蛋白主要由六邻体蛋白（hexon）、五邻体蛋白（penton）和纤维蛋白（fiber）构成，其中hexon蛋白含主要抗原决定簇，参与免疫反应，能诱导产生中和抗体，并且与病毒致病性密切相关。国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）将腺病毒科分为5个属，分别为哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）、禽腺病毒属（Aviadenovirus）、胸腺病毒属（Atadenovirus）、唾液腺病毒属（Siadenovirus）和鱼腺病毒属（Ichtadenovirus）。腺病毒可以感染40多种脊椎动物，其中禽类是其常见宿主。
禽腺病毒是鸽群中的一种常见病原体。1984年，Cousement等在比利时首次报道了鸽腺病毒（pigeon adenovirus，PiAdV）感染，随后该病毒在世界范围广泛传播。1995年，De Herdt等描述了I型和II型PiAdV感染在特定鸽子中的相关致病过程。I型或II型的分类不是以抗原性差异为依据，而是以感染后引起的临床症状作为分类标准。I型PiAdV（PiAdV-I，为经典腺病毒）感染的临床症状与幼鸽疾病综合征（young pigeon disease syndrome，YPDS）类似，主要影响1岁以下的鸽，表现为腹泻、吐食、消化缓慢和体重下降等；II型PiAdV（PiAdV-II）可感染所有年龄段的鸽，引起的死亡率更高，临床特征更典型，导致广泛性的肝坏死或突然死亡。目前还没有针对PiAdV的疫苗，因此PiAdV感染给我国赛鸽及肉鸽养殖业带来了严峻挑战及经济损失。当前，关于我国PiAdV感染的流行病学研究较少，其在我国的分布尚不清楚。因此，开展PiAdV的分布和流行规律研究，对我国PiAdV感染的精准防控具有重要意义。本研究于2021—2022年，在我国8个省（自治区）41个活禽交易市场，采集鸽口咽/泄殖腔双拭子样品，通过常规PCR方法检测PiAdV核酸，并对阳性样品进行遗传进化分析，以期为科学防控PiAdV感染提供流行病学数据。
材料与方法
样品来源
从江苏、河南、安徽、江西、福建、广东、广西、云南等8个省（自治区）的41个活禽交易市场，随机采集鸽的口咽/泄殖腔双拭子样品，共计462份。
核酸提取
采用FinaQuick快速病毒DNA柱式提取试剂盒（GENFINE），按照说明书进行病毒DNA提取，将提取的DNA立即用于PCR扩增或者于-20 ℃保存。
PCR扩增
根据相关研究，针对PiAdV的hexon蛋白编码基因保守区域设计引物，PCR产物预期长度为616 bp，引物由青岛睿博兴科生物技术有限公司合成。用提取的DNA作为模板，进行PCR检测。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环；72 ℃延伸5 min。扩增后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳。
PCR扩增产物序列测定
PCR扩增产物按照北京全式金快速胶回收试剂盒说明书进行纯化回收，纯化后的DNA产物送至青岛睿博兴科生物技术有限公司进行序列测定。
遗传进化分析
利用MEGA 6软件，针对腺病毒hexon蛋白编码基因序列，采用邻位相连法（neighbor-joining）构建系统进化树，分析病毒的遗传进化特点。
结果
病原检测
总体情况 病原检测结果（表1~2）显示：2021—2022年在河南、安徽、江西、福建、广东、广西、云南等7个省（自治区）24个活禽交易市场检出120份PiAdV病原阳性样品，个体阳性率为25.97%（95%CI：21.98%~29.97%），场点阳性率为58.54%（95%CI：43.46%~73.62%）。
地区情况 阳性场点分布范围较广，除江苏省外，其他采样省份均有阳性检出，不同省份的PiAdV阳性率有一定差异。其中：江西（40.00%）、广西（39.08%）个体阳性率较高，而云南（5.56%）、安徽较低（3.13%）。
场点类型情况 24个PiAdV阳性采样点包括17个零售市场和7个活禽批发市场。场点统计结果（表2）显示，活禽批发市场的场点阳性率高于零售市场，分别为87.50%和51.52%。
遗传进化分析
随机挑选来自不同省份的15份PiAdV病原阳性样品进行基因测序，测序结果经BLAST比对发现，均符合PiAdV序列。选取GenBank公布的21株（表3）具有代表性的腺病毒hexon蛋白编码基因序列与本研究测定的hexon蛋白编码基因构建遗传进化树。结果显示：本研究的15份PiAdV阳性样品均属于PiAdV-B分支（图1），与2018年国内检测到的PAV/FJ2017株亲缘关系最近，同属于PiAdV-B中的varient B小分支，核苷酸同源性为99.1%~100%，与PiAdV-B同分支中varient A小分支的YPDS-Y-V1.A19.11和M144毒株的核苷酸同源性为83.3%~84.0%，而与同物种的PiAdV-A分支亲缘关系较远，与该种IDA4分离株的核苷酸同源性只有65.0%~66.0%。
讨论
近年来，我国养鸽业发展迅猛，鸽饲养数量逐步增加，养鸽业已经成为我国继鸡、鸭、鹅之后的第四大家禽产业。但是当前对于鸽相关疾病的系统流行病学研究较少，对疫病的种类、分布、危害等尚不清楚。PiAdV是鸽群中常见的病原体，其中鸽典型PiAdV感染临床上主要表现为嗉囊积食、腹泻、吐食和体重下降等症状，当其与其他病原发生混合感染或者机体抵抗力较低时，会导致鸽死亡率明显升高，严重影响着养鸽业健康发展。为了解PiAdV在我国的流行现状，本研究对2021—2022年在江苏、河南、安徽、江西、福建、广东、广西、云南等8个省（自治区）41个活禽交易市场采集的鸽拭子样品进行病原检测，结果发现个体阳性率为25.97%，其中江西省的个体阳性率高达40.00%。史磊波对西安市周边地区采集的396份鸽泄殖腔拭子样品进行PiAdV核酸检测，发现样品阳性率为14.6%；杨俊杰对呼和浩特市周边公棚采集的107份赛鸽泄殖腔拭子进行PiAdV检测，发现阳性率为32.7%；习硕等对北京、河北、江西、山东、河南5个地区552份鸽血清样品进行PiAdV检测，发现血清阳性率为62.3%。以上研究表明，PiAdV在我国鸽群中流行广泛。
根据ICTV分类报告，同物种的PiAdV分为PiAdV-A和PiAdV-B种。本研究所测定的PiAdV均处于PiAdV-B分支，与2018年国内检测到的PAV/FJ2017株亲缘关系最近，与同属于PiAdV-B分支varient B小分支病毒的核苷酸同源性为99.1%~100%，与PiAdV-B同分支中varient A小分支的YPDS-Y-V1.A19.11和M144分离株的核苷酸同源性为83.3%~84.0%，而与同物种的PiAdV-A种分支中的IDA4分离株同源性较低。本研究同时使用史磊波报道的针对PiAdV-A种引物进行样品核酸检测，均未检测到PiAdV-A种病原学阳性，只检测到PiAdV-B种阳性，表明我国鸽群中主要流行PiAdV-B种病毒。根据PiAdV感染后引起的临床症状差异的分类标准，本研究所采集的拭子样品均来自活禽交易市场无明显临床症状的鸽，因此检测到的PiAdV均属于PiAdV-I型。
值得注意的是，本研究所检测到的120份PiAdV病原学阳性来源于24个采样点，场点阳性率高达58.54%，包括17个零售市场和7个活禽批发市场，说明活禽批发市场和零售市场是PiAdV的高污染场点。活禽市场中禽种类繁多，存在多种禽类混养、来源复杂、市场卫生条件较差等现象，极易导致病毒传播和混合感染。因此，应加强活禽市场的卫生消毒管理，积极采取定期休市、严格清洗消毒等措施。同时，本研究只针对各地区活禽交易市场鸽群的感染情况进行了初步检测与分析，研究结果存在一定的局限性，要获得更为准确的流行病学数据仍需结合养殖环节鸽群的检测结果进行深入研究探讨。
由于市场上暂无针对PiAdV的专用疫苗，因此对于该病的防控，要注重加强饲养管理，增强养殖业主的生物安全意识，改善养殖环境，提高鸽群抵抗力，利用有效手段降低病毒的感染、变异和传播风险，尽快研发PiAdV针对性疫苗，完善防控物质储备，提高防控能力。
结论
研究表明，我国市场交易鸽群中存在PiAdV流行，且部分市场污染面较广，感染率较高，PiAdV-B种为优势流行毒种。建议加强鸽场的饲养管理，提高鸽群抵抗力，同时加强活禽交易市场的卫生管理，防止病毒扩散，加快开展PiAdV疫苗研发，从而有效防控鸽腺病毒病流行。
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