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动物源性食品中霉菌毒素的检测——杂色曲霉素
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2021/7/20 11:23:19 关注：916 评论： 我要投稿
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杂色曲霉素（sterigmatocystin，ST）是一类结构类似的化合物，它主要由杂色曲霉Aspergillus uersicolor）和构巢曲霉（Aspergillus nidulans）等真菌产生，主要污染玉米、花生、大米和小麦等食物，它具有强烈的致癌性并且可以转化为AFB1。本部分综述了ST的理化性质、毒理与危害、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，以期为该类污染物的全面了解和残留检测提供参考。
1 理化性质
其基本结构由二呋喃环与氧杂蒽醌连接组成（图4-7），与AF结构相似，并且可以转化为AFB1。ST为微黄色针状结晶，易溶于氯仿、苯、吡啶、乙腈和二甲基亚砜，微溶于甲醇、乙醇，不溶于水和碱性溶液。以苯为溶液时，其最高吸收峰波长为325nm，摩尔吸光系数ε为15200，分子式为C18H12O6，相对分子质量为324，熔点为246～248℃。在紫外线照射下具有砖红色荧光。ST的衍生物包括O-甲基ST、双氢-O-甲基ST、5-甲氧基ST、双氢脱甲氧基ST、二甲氧基ST，但是对人和动物危害最严重的为ST。
2 毒理学
动物可经多种途径吸收ST。Wistar大鼠经口、皮肤和腹腔注射ST染毒，可诱发不同部位癌变。哺乳动物体内ST主要是由于进食被杂色曲霉或ST污染的食物或饲草而染毒，通过呼吸道和皮肤染毒的机会很少。
动物毒理学和遗传毒性试验均表明ST具有致癌、致突变作用，且存在明显的剂量-效应关系。我国有研究人员在人消化道肿瘤组织中检出了ST-DNA加合物。
2.1 急性毒性与慢性毒性
ST急性中毒的病变特征是肝脏、肾脏坏死；慢性中毒主要表现为肝硬化和肝脏坏死等。关于ST的半数致死量（LD50），经口服，雄性大鼠为166mg/kg，雌性大鼠为120mg/kg，小鼠大于800mg/kg；猴的敏感性比啮齿类动物高，经腹腔注射LD50为32mg/kg。
2.2 致癌性
试验证明，ST是具有较强致癌作用的致癌因子，其致癌作用仅次于AF。在我国食管癌、胃癌和肝癌高发地区，居民食用的粮食中ST的检出率和含量均比较高，有学者在胃癌和慢性胃病者的胃液中也分离出ST，而且在从胃内检出的优势真菌毒素中，ST占第一位，检出率分别为61.89%和38.89%，占真菌毒素的首位。
2.3 对免疫功能的影响
ST可诱导人外周血淋巴细胞发生凋亡，在0～2mg/L浓度范围内，ST处理24h后人外周血单核细胞（human peripheral blood mononuclear cells，HPBMC）的白细胞介素-2（IL-2）分泌受到一定程度的抑制。在1～64h的范围内，ST（1mg/L）对HPBMC的IL-2分泌具有抑制作用，随ST处理时间的延长，对IL-2分泌的抑制作用逐渐增强。
2.4 对实质器官的影响
ST对机体重要生命器官组织影响的研究结果显示，经口灌胃不同剂量ST（3μg/kg、30μg/kg、300μg/kg和3000μg/kg），均可呈现剂量及时间依赖性地促进小鼠肝细胞和肾细胞的凋亡。单次灌胃ST（3μg/kg 12h或3mg/kg 6h）均可诱导小鼠大脑皮质、丘脑、海马CA2区神经元发生退行性病变，提高大脑细胞凋亡率。
3 危害
关于食品中ST的污染情况，国内外学者做了许多研究。楼建龙等对肝癌、胃癌高发区和低发区粮食中ST进行了调查，发现高发区粮食中ST检出率和检出量均高于低发区。加拿大农业部谷物和油料作物研究中心发现，带壳大麦在15%～19%相对湿度条件下ST平均水平可达411μg/kg。Ascedamore等发现动物工业饲料中含有60%或更多包括ST在内的真菌毒素。田禾菁等对我国12个省份的小麦、玉米和大米中ST的污染状况进行了调查，发现我国三种主粮ST污染率均较高，除大米污染率为72%外，小麦、玉米污染率均在90%左右。
ST产生菌及ST在世界各地粮食及饲料中的污染很常见，甚至在潮湿的房屋内也可检出ST的污染。Wilson等认为在粮食收获前后最易有真菌生长或受霉菌污染的农产品主要包括玉米、花生、棉籽、稻米、坚果和水果。肉、奶和蛋等动物类产品也可因为动物摄入被污染的食物而遭到污染。国内学者研究发现，我国各地粮食中ST的污染非常普遍，其中以小麦最明显，污染率最高可达100%。Wareing等对市场上的木薯进行了调查，发现所采集的10个样品中ST含量在0.17～1.67μg/kg。
4 国内外限量要求
由于ST的毒性大，而且各类动物都易感染，容易引起中毒，故需要规定饲料和日粮中ST的安全剂量，但是目前给出具体的限量标准的国家很少。捷克和斯洛伐克规定大米、蔬菜、面粉、禽肉、猪肉和牛奶中的MRL为5μg/kg，其他食物中的MRL为20μg/kg。我国杨曙明等推荐饲草及日粮中ST的允许量为：饲草≤200μg/kg，大麦和玉米≤100μg/kg，豆饼和花生饼（粕）≤1500μg/kg，配合饲料≤80μg/kg。
5 样品前处理方法
5.1 样品提取
5.1.1 甲醇法
称取20g饲料，洗净烘干，经粉碎后过20目筛，之后置于具塞锥形瓶中，加80mL甲醇-4%氯化钠溶液（体积比9:1），振荡30min后过滤，收集滤液40mL，移入250mL分液漏斗中，再加入25mL 4%氯化钠溶液和25mL石油醚，振摇2min，静置分层。上层石油醚溶液置于锥形瓶中，下层溶液仍移入原分液漏斗中，再用25mL石油醚提取1次。最后将2次上层的石油醚溶液合并，加入25mL甲醇-氯化钠溶液（55:45，V/V），振摇30s，将下层并于原甲醇水层中，重复用甲醇-氯化钠溶液（55:45，V/V）提取2次，以提取该层的ST。下层溶液合并后加30mL三氯甲烷，振摇2min，静置，待上层浑浊液有部分澄清时，即可将下层溶液倾倒至有约10g无水硫酸钠的定量慢速滤纸上过滤于蒸发皿中，于分液漏斗中再加10mL三氯甲烷，重复提取1次，将该下层溶液和用少量三氯甲烷洗滤的洗液一并放入蒸发皿中，将蒸发皿置于65℃水浴上蒸干，然后再在冰浴上放置2～3min，加1.0mL苯将残留物充分混匀，置入小试管中，或将以上蒸发皿中残留物用三氯甲烷移于浓缩管中，于65℃用减压吹气法浓缩至干，加入1.0mL苯，供色谱测定，此1mL样液相当于10g样品。
5.1.2 乙腈法
称取20g饲料，洗净烘干，经粉碎后过20目筛，之后置于具塞锥形瓶中，加入80mL乙腈-氯化钾溶液（90:10，V/V），振荡30min，过滤。收集样品液40mL，移入250mL分液漏斗中，再加入20mL正己烷，振摇，静置分层。当底层清晰时，弃去上层正己烷，再用20mL正己烷重复提取1次，弃去正己烷层，在乙腈-水层中加入10mL水和20mL氯仿，振摇。在上层清晰时，收集底层氯仿于蒸发皿中，上层再用10mL氯仿提取1次，合并氯仿，将蒸发皿置于65℃水浴上蒸干，然后再在冰浴上放置2～3min，加1.0mL苯将残留物充分混匀，置入小试管中，供色谱测定，此1mL样液相当于10g样品。
胡伟莲等分别用甲醇法和乙腈法对各种饲料及配合饲料进行ST的添加回收试验，ST的添加量为100μg/kg，测定回收率，并重复10次计算其回收率和相对校准偏差。结果见表4-3。同时随机取发霉鸭饲料、稻谷、玉米、豆饼和菜籽饼，也同时用甲醇法和乙腈法分别检测其中的ST含量。研究发现，用甲醇法和乙腈法测定饲料中ST的含量时，其回收率为88.1%～91.4%，同时RSD较小，重复性好，因此可以用于饲料中ST的快速测定。其中甲醇法所用试剂为常用试剂，毒性小，但操作过程相对复杂；乙腈法使用试剂乙腈有剧毒，但操作过程相对简单，故认为此两种方法都可以作为饲料厂简便快速检测ST的方法。
5.2 样品净化
5.2.1 固相萃取柱净化
固相萃取一般有四个基本步骤：固定相活化、样品上柱、淋洗和分析物洗脱。其一般步骤是：将液态样品或溶解后的固态样品倒入活化过的固相萃取柱，然后利用抽真空或加压使样品进入固定相。固相萃取步骤中将目标组分先保留，不需要的组分先用一种溶剂冲洗掉，然后用另一种溶剂把目标分析物从固定相上洗脱下来。固相萃取柱净化法优点是方法简便，使用的有机试剂较少，对环境和试验人员的危害较小，但由于它对样品中毒素的作用力为非特异性吸附力，因此对毒素的净化纯度和回收率不可能同时达到很高。
5.2.2 硅镁吸附柱层析分离纯化
将硅镁型吸附剂置于烘箱中，130℃下烘干2h，放入干燥器中备用。使用前2d取出，称20g硅镁型吸附剂放在烧杯中，加1mL水混匀。密闭平衡48h使其活性符合使用要求。取长30cm、内径1cm的层析柱3支，分别加入经130℃烘干2h的无水硫酸钠1cm。加正己烷8mL，用玻璃棒轻轻搅动排出无水硫酸钠层内的气泡。在装有5mL硅镁型吸附剂的烧杯中加入15mL正己烷，轻轻搅动使其悬浮。打开层析柱下口活塞使柱内正己烷缓慢流出，同时将悬浮液分别倒入柱中，使其自然下沉，当正己烷下降至吸附剂层面以上3cm时，关闭活塞，分别加入无水硫酸钠2cm。然后将吸附柱中正己烷放出，使液面至上层无水硫酸钠表面。样品提取液上柱净化。当液面接近上层无水硫酸钠表面时，加入2倍体积的洗脱剂，以2mL/min流速洗脱。收集洗脱液，用氮吹仪挥干。最后用1mL甲醇水溶液（70:30）溶解。
6 检测方法
目前用于检测ST的方法有薄层色谱法（TLC）、ELISA、高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）等。TLC操作简单，不需要复杂精细的仪器设备；HPLC、LC-MS等检测灵敏度高、可靠性强，但需要昂贵的仪器设备和专门的操作人员，并且处理复杂，无法同时对大批量样品进行检测；ELISA灵敏度高，特异性强，预处理简单，且不需要昂贵的仪器设备，但其前提条件是先制备ST抗体，限制了ELISA在生产实际中的使用。
6.1 薄层色谱法（TLC）
目前我国在食品上已有检测ST的国家标准，其原理是将样品中的ST经提取、净化、浓缩、薄层展开后，用三氯化铝显色，再经加热产生一种在紫外光下显示黄色荧光的物质，根据其在薄层上显示的荧光最低检出量来测定样品中ST的含量。
样品经提取后进行点样：取两块10cm×10cm薄层板，在距板下端0.8～1cm处各添加10μL标准使用液（1.0μg/mL），在左边缘4cm处各添加80μL样液，然后再在第二块板的样液点上加滴10μL标准使用液（1.0μg/mL）。之后进行展开，常用横向展开剂为15.6mL乙醚-正己烷-苯-三氯甲烷-甲酸（3:9:15:15:06，V/V），纵向展开剂为15mL苯-甲醇-冰乙酸（90:8:2或925:6:15，V/V）。最后进行显荧光，用三氯化铝-乙醇溶液，置80℃加热10min，立即在紫外光灯（波长365nm）下观察结果，待薄层板冷却后再薄薄地喷第二次（不需加热），可直接观察结果，根据其在薄层上显示的荧光最低检出量来测定样品中ST含量。
胡伟莲等对玉米、豆饼、菜籽饼、棉籽饼、小麦等饲料进行ST的添加回收试验，结果表明各饲料的回收率均大于88%，RSD为2.3%～3.4%。
Stroka等从各种谷物中提取ST，经固相萃取（SPE）净化后用TLC测得谷物中ST的检测限为2μg/kg。ST的分离和鉴定是通过高效薄层色谱（HPTLC）板。通过对HPTLC板的加热来实现对衍生化的光密度的测定，在板上ST为高密度的荧光点。使用该检测方法的回收率均较高，其中小麦中回收率在80%左右。
6.2 ELISA
用包被抗原包被酶标板，明胶封闭，加入待检样品和抗ST单克隆抗体竞争反应，加酶标记羊抗鼠IgG，加邻苯二胺底物液显色，加2mol/L硫酸终止反应，用酶标仪检测。然后绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数，从而求出样品中ST含量。
田禾菁等用ELISA检测ST，得出标准曲线的线性范围为0.01～1.0ng/mL，检出限为0.01ng/mL。在样品中加入1～100μg/kg不同浓度的ST，测得加标回收率为85%～115%。
6.3 高效液相色谱法（HPLC）
用HPLC检测时，使用Micro Bondapak C18柱，流动相为四氢呋喃-甲醇-水（5:1:4，V/V），流速为1.0mL/min，荧光检测时激发波长（λex）365nm，发射波长（λex）435nm，狭缝宽度为10nm。
用HPLC检测时标准溶液的配制：准确称取0.68mgST标准品，用2mL乙腈溶解，再用甲醇定容至25mL容量瓶中，摇匀后备用。取1mL高浓度标准溶液（27.19μg/mL），用甲醇-水溶液（70:30，V/V）定容至25mL容量瓶中，配成低浓度（1.09μg/L）的溶液，在上述色谱条件下，ST的保留时间为3.974min。
黄化成等用HPLC在加标量为2.0μg/kg时测得花生粕中ST的平均回收率为89.6%，在加标量为5.0μg/kg时测得混合饲料中ST的回收率为94.3%。
袁建等建立了检测小麦中ST含量的HPLC。在样品中的ST经正己烷提取后，采用国产硅镁型吸附剂制备层析柱净化后，运用HPLC测定，色谱柱为Nova-Pak C18柱，以甲醇-水（70:30，V/V）为流动相，流速0.7mL/min，检测波长为246nm。结果：该方法平均加标回收率为79.26%，RSD为3.84%，最低检出量为0.017μg/kg。
6.4 液相色谱-质谱联用（LC-MS）
将Waters Alliance2695液相系统连接到三重四极杆液质联用仪上，在分析ST时电喷雾探头采用正离子模式。流动相为含0.01%甲酸的乙腈和0.01%的甲酸水（75:25，V/V），采用C18色谱柱，流速为0.3mL/min，柱温为30℃。注射器为50μL，用ST标准品对质谱仪的参数进行优化。
Versilovskis等用LC-MS在小麦中进行ST的添加回收试验，并对污染ST的小麦、芥麦、大麦等谷物样品进行试验。由于基质效应的影响，因此在空白小麦样品中添加ST并绘制标准曲线，结果表明线性关系良好，小麦样品中的检测限为0.5μg/kg，样品回收率在97%以上，并且重复性良好。添加回收试验数据见表4-5。
Scudamore等用LC-MS对玉米、面包等进行ST的检测，得到玉米中的检测限为1.7μg/kg面包中为1.9μg/kg。
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| 文章作者：曲志娜 赵思俊等 中国兽医发布 文章编辑：一米优讯 |
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