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家畜精子耐冻性机制研究进展
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2018/1/5 21:39:52 关注：379 评论： 我要投稿
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精液冷冻保存技术在家畜新品种培育方面具有重大意义。早期研究认为，在家畜精液预处理降温过程中，不同家畜个体精子对“低温打击”敏感度存在明显差异，这可能是造成公畜精子耐冻性不同的直接原因。推测原因可能是不同种属或品种的精子质膜组成成分存在较大差异，然而确切的精子耐冻性影响机制仍不清楚。
近十几年来，随着蛋白质组学和转录组学等研究手段在动物精子上应用日益成熟，使得从系统生物学的思路探索精子耐冻性影响机制成为可能，并取得了一些进展。本文对家畜精子耐冻性机制的相关研究方法及进展进行了综述，以期为揭示其影响机制及推动家畜精液冷冻保存技术发展提供借鉴。
1 人类及动物精子机理性研究的主要方法
早期在DNA 水平研究发现，生理功能异常的精子很少有基因序列发生改变，而其生理功能异常可能是转录或翻译过程中造成的，故在DNA 水平探索精子相关机制存在较大局限性。蛋白质是细胞增殖、分化、衰老和凋亡等重大生命活动的执行者， 生理功能的产生以及病理性变化往往由蛋白质群体甚至整体共同完成。RNA 是DNA 和蛋白质之间进行遗传信息传递不可少的“媒介”，RNA 和DNA 在生命的进程中均扮演着重要的角色。近几年来， 蛋白质和RNA 微量提取、相关定性与定量的高通量检测等技术相继问世以及生物信息学飞速发展， 使得在蛋白质和RNA 水平对精子通过比较分析研究探索其生理功能异常成为可能。目前，高通量的蛋白质组学和转录组学技术已广泛用于人类及家畜精子研究领域。
1.1蛋白质水平
自蛋白质组学研究手段问世以来， 研究者就开始将其应用于男性不育及动物繁殖研究。除精子外，精浆作为精子的天然培养基，其中的精浆蛋白也是重要研究对象。对动物精子蛋白和精浆蛋白通常采用比较蛋白质组学的研究思路，即通过对精子/ 精浆蛋白在不同空间、不同时间上动态变化着的蛋白质组进行比较，分析不同蛋白质组之间的蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异。双向电泳（Two-dimensional Electrophoresis，2-DE） 对极酸或极碱蛋白、分子量极大（大于200 ku）或极小（小于10 ku）蛋白及难溶蛋白的分离存在局限性， 且操作稍繁琐、重复性差等。目前，iTRAQ 等新的高通量、精准的蛋白质定性与定量技术已逐步取代2-DE- 质谱体系，成为蛋白质组学研究的普遍手段。
迄今为止，比较蛋白质组学已广泛地应用在人类和几乎所有家畜精子研究中，在探索男性不育机制及寻找一些家畜精子生理功能相关标记蛋白等方面取得了较大突破，建立了较成熟的针对精子/ 精浆蛋白质提取、分离、鉴定以及生物信息学分析以及进一步对重要蛋白进行细胞内定位、功能等深入研究的技术体系。在男性不育方面，早期研究者利用2-DE 电泳- 质谱技术体系建立了不育男性和正常男性差异精子蛋白数据库，并从中发现了一些重要功能蛋白。在家畜上，一些研究者利用2-DE 电泳结合蛋白质定量检测手段发现了一些与家畜性别相关的精子蛋白。如Huang 等研究猪冷冻精子解冻后精子蛋白的变化，发现热休克蛋白-90 （HSP-90)）解冻后含量明显下降，推测该蛋白可能与精子运动性能相关；也有研究发现，公猪精子中存在一些与母猪窝产仔数高度相关性的标记蛋白， 表明公猪是育种工作中提高窝产仔数指数不可忽视的因素。
精浆作为动物精子的天然培养基，其中的蛋白即精浆蛋白在精子整个生理过程尤其在受精过程发挥着不可忽视的作用，也已引起研究者们的广泛关注。研究已证实，在人和家畜等精浆中均存在种类丰富的蛋白，可能通过与精子表面结合来对精子产生影响，被认为是男性不育及雄性动物生殖障碍潜在的诊断标记。其中：
Brandon 等在马精浆中发现4 种蛋白与公马的生育能力相关； Bergeron 等认为绵羊精浆中的Spermadhesin 族蛋白可能对精子获能及精卵结合均有影响； Huang 等在猪精浆中发现1 个热应激蛋白HSP-70 在高温季节明显降低，后证实HSP-70 与猪子受精能力存在相关性。
Caballero 等 发现低浓度的Spermadhesin 族蛋白PSP-I/PSP-II 的异质二聚体可以延长高倍稀释猪精液的存活时间。
此外，有研究也发现人类及家畜精浆中存在一些具有抗菌功能的蛋白（即抗菌肽） 在维持精子正常生理功能中发挥着重要不可忽视的作用，精液中的抗菌肽提取、鉴定及生物合成也已成为当前生殖生物学领域一个研究热点。
1.2 RNA 水平
随着生命科学研究步入功能基因组学时代，在RNA 水平研究特定生理功能状态下细胞或组织基因的表达情况和调控规律，已成为一个重要的研究热点。目前，RNA 水平主要研究对象为mRNA、miRNA 和lncRNA 等， 其中后二者为非编码RNA，研究手段主要有基因芯片（Biochip 或Microarray） 和RNA-Seq 等高通量方法。基因芯片方法将提取RNA 反转录为cDNA 并进行荧光探针标记，通过检测芯片上各点信号强弱衡量该探针目的基因的表达量，可以快速分析大量样本，该技术局限性是分析高度依赖已知的基因组信息。而RNA-Seq 测序技术不再需要设计探针，可对任意物种的整体转录产物进行检测，可以揭示小RNA 和新基因，已成为目前在RNA 水平进行深入研究不可缺少的工具。
早期普遍认为，精子发生后转录功能处于停滞状态，在被致密包装精子中染色质存在RNA 的可能性很小。但随后研究相继发现，成熟精子不仅有种类繁多的RNA，且精子RNA 在精子发生和存活及精卵结合等过程中都起着重要作用，并可能作为遗传物质进入卵母细胞。然而，精子中的RNA 含量极低，鱼精蛋白和DNA 等被高度压缩且受细胞膜包裹，使得精子RNA 提取一直是制约相关研究发展的瓶颈。近几年来，精子RNA 提取和扩增技术的突破以及高通量RNA-Seq 技术有力地推动了精子在RNA 水平研究。
精子RNA 水平研究早期在男性不育领域较多， 基因芯片（cDNA Microarrays） 和高通量测序等手段先后广泛应用，是男性不育生成机制及诊断研究发展的重要推动因素之一。在家畜中， 转录组学在牛精子的相关研究中涉及较多。研究者们利用抑制消减杂交法（Suppression-Subtractive Hybridization，SSH）和基因芯片等技术在牛上进行了生育能力相关精子基因的筛选。
近几年来，无编码功能的miRNA 的生物学功能开始受到重视。已有研究证实，miRNA 可通过其靶基因与相关信号通路建立相互调控及协同模式， 间接实现了对细胞或生物体生理功能的调控。在现有技术条件下，结合现有芯片技术和高通量测序技术，可实现高效、大规模地发掘，并对序列信息已知和未知miRNA 进一步研究其基因调控功能。
通过对精子miRNA 表达谱进行比较分析，也是探索男性不育及动物精子生理功能异常机制的有效途径之一。
在男性不育方面，Liu 等和Wang 等分别利用miRNA 芯片和Solexa 测序在男性精子和精浆中发现不育相关miRNA ；? 在哺乳动物方面，Lagos-Quintana 等首次报道在老鼠精子中发现影响胚胎发育的miRNA；? Fagerlind 等在奶牛上筛选并鉴定了7 个与生育力相关miRNA；在猪精子中也已发现5 个与精子形态和运动性能相关miRNA。
此外，研究者也发现RNA 或蛋白发挥其生理调节功能均涉及众多的信号通路，如miRNA 被认为是基因调控和信号通路网络中不可缺少的调节器，通过其靶基因与相关信号通路建立了相互调控及协同模式，间接实现了对细胞或生物体生理功能的调控。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-Activated Protein Kinase，AMPK）即为与猪精子功能调控相关的重要信号通路。
2 家畜精子耐冻性机制研究动态
关于家畜精子耐冻性影响机制， 研究者们先后在DNA、RNA 和蛋白质等水平分别从精子和精浆着手展开研究并取得了一些进展。在分子水平上，Thurston 等利用应用限制性片断长度多态方法发现16 个猪精子耐冻性相关的候选基因，但阐明其确切机制仍存在较大局限性。
研究发现，动物精子经冷冻- 解冻过程会发生精子蛋白缺失、表达水平异常等，意味着精子比较蛋白质组学研究可能是揭示其耐冻性影响机制的一条途径。
在蛋白质水平上，猪和牛等家畜的精子/ 精浆蛋白与其精子耐冻性之间存在显著相关性。
不同家畜个体的精浆在精液降温过程中可增强抗“低温打击”能力，推测可能是某些精浆蛋白在降温过程中发挥着主要作用。
在牛上，有研究发现精浆中BSP 族蛋白不仅影响精子运动性能，还可能通过在冷冻前降温平衡过程增强其精子抗“低温打击”能力从而影响精子的耐冻性；?Barrios 等和Rickard 等 均证实在不同品种绵羊中存在一些与精子耐冻性相关的精浆蛋白。
与其他家畜相比， 猪精子在品种间和个体间耐冻性差异最为显著。在猪精子耐冻性方面，西班牙Bonet 教授研究团队先后利用免疫标记（Immunolabeling Assay）、双向荧光差异凝胶电泳（2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis，2D-DIGE） 结合Western blot 技术分离、鉴定了多个猪精子耐冻性相关蛋白；?Vilagran 等研究发现， 皮特兰猪的精浆蛋白fibronectin-1（FN1）与猪精子耐冻性存在相关性， 可以作为评价精子耐冻性的标记蛋白。
国内对精子耐冻性在蛋白质水平上研究仅见张欣宗等报道， 该研究利用2D-MS 技术对在人精子/ 精浆的蛋白进行分离、鉴定和生物信息学分析，共计发现22 个可能与人精子耐冻性相关的精子/ 精浆蛋白。
3 展 望
随着蛋白质组学及转录组学等高通量手段的飞速发展及其在人类和家畜精子中广泛应用，使得在DNA、RNA 以及蛋白质多个水平，以系统生物学的思路全面地探索家畜精子耐冻性影响机制成为可能。预期在不久的将来，家畜精子耐冻性影响机制将逐渐揭下面纱，家畜精液冷冻保存技术将实现质的突破，从而推动家畜精液冷冻保存技术在种质资源保护、育种和生产中广泛应用，在提升优秀种公畜种用价值乃至新品种培育等方面均有较大意义。（参考文献略）
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| 文章作者：张树山，等 中国畜牧杂志 文章编辑：一米优讯 |
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