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冷冻保存技术作为精液长期保存方法，可以提高种公羊的利用率、隔绝疾病扩散和保种，但由于绵羊精子不耐冻，解冻后常常出现精子活率、顶体完整率、受胎率降低等，导致绵羊精液冷冻保存技术未能在生产中广泛推广。吐鲁番黑羊是新疆吐鲁番托克逊县农牧民长期自然选育形成的优质地方品种，其对炎热干旱环境适应性强且羔羊肉品质优良。近几年吐鲁番黑羊数量急剧减少，优化吐鲁番黑羊精液冷冻保存技术显得尤为重要。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种表面活性剂，可作为精子冷冻稀释液保护剂，但在绵羊精液冷冻稀释液中添加SDS 的研究尚未见报道。
实验方法
本实验在3 种精液冷冻稀释液中添加不同浓度（0、1%、2%）的十二烷基硫酸钠（SDS），Tris- 葡萄糖- 柠檬酸钠为I 液，蔗糖- 葡糖糖- 柠檬酸钠为II 液，Optidyl 稀释液做对照为III 液。I液和II液均为一步法稀释，成分见表1。熏蒸冷冻后解冻，用精子分析系统（CASA）和流式细胞仪检测冷冻效果。
结果分析
综合形态运动指标（表2），I液1% SDS组、I液2% SDS组、II液1% SDS组和III液1% SDS组精液冷冻效果较好，可作进一步检测以确定最优冷冻配方。
如表3显示，I液1% SDS组质膜完整率和顶体完整率显著高于I液2% SDS组和II液1% SDS组。I液1% SDS组的顶体完整活精子比例、高线粒体膜电位精子比例显著高于II液1% SDS组。
讨 论
☉ 冷冻稀释液对吐鲁番黑羊精液冷冻效果的影响
精液冷冻稀释液主要作用是改善精子外环境的渗透压与pH，防止精子细胞内成分流失，为精子运动提供能量，降低高度稀释对精子产生的损伤并起到冷冻保护作用，给精子适应外界环境创造有利条件。由于冷冻过程中带来的机械损伤，冷冻解冻后的精液仍有部分精子死亡和失去运动能力。因此，冷冻后精子活率和膜结构完整性对解冻复苏后的受精能力至关重要，所以人们一直在探索有效的稀释液成分来提高冷冻效率。目前研究报道，Tris 具有良好的渗透性和缓冲性，并且添加适量浓度时对精子毒性较低，冷冻稀释液中添加Tris 能提高精子活力以及顶体完整率。绵羊的精液具有相对较高代谢水平的特殊性，在有氧环境下可以致使精子氧化导致中毒死亡。
葡萄糖、果糖、蔗糖以及乳糖等均可通过提高冷冻复苏后质膜稳定性保护精子。非渗透性保护剂蔗糖可与精子质膜直接发生反应，降低冷冻过程中冰晶对精子造成的损伤。本实验表明，添加相同浓度的SDS 时，Tris- 葡萄糖- 柠檬酸钠冷冻稀释液冷冻- 解冻后精子活率最高，精子畸形率和运动速率也均优于蔗糖- 葡糖糖-柠檬酸钠和OPtidyl 稀释液组。3 种稀释液添加1%SDS时，Tris- 葡萄糖- 柠檬酸钠组在质膜完整性、顶体完整率和高线粒体膜电位上显著优于蔗糖- 葡糖糖- 柠檬酸钠组，与OPtidyl 稀释液组没有显著差异。造成I 液和II 液效果差异性的原因在于Tris 是渗透性保护剂，使精子能更好地耐受低渗和高渗；而蔗糖是非渗透性，当稀释液的渗透压和pH 不稳定时，可能就会造成精子的损伤以及死亡。
☉ 添加SDS 对吐鲁番黑羊精液冷冻效果的影响
SDS主要作用是防止低温对精子的机械损伤，对精子膜结构有保护、修补作用，能够显著提高冷冻解冻后精子活率、顶体完整率及质膜完整率。在稀释液中添加卵黄可以维持稀释液的胶体渗透压，保护精子质膜完整性和顶体膜减缓阳离子肽造成的损伤。SDS与卵黄类脂协同完成对质膜及顶体膜结构的保护，减少顶体内营养物质的渗透和流失。
本实验结果表明，在3 种冷冻稀释液中添加1%SDS 时，精液冷冻解冻后的精子活率、畸形率和直线运动速率均显著优于不添加SDS 组和添加2%SDS 组；Tris-葡萄糖-柠檬酸钠冷冻稀释液添加1% SDS 组质膜完整性和顶体完整率较2%SDS 组均显著提高，添加1%SDS 组的高线粒体膜电位精子比率与2%SDS组没有显著差异，但有提高趋势。
SDS 是一种对细胞微毒的阴离子表面活性剂，当添加2%SDS时，过量的SDS 容易对精子造成损伤，进而降低冷冻效果，所以II 液和III 液中添加2%SDS 解冻后精子活率低于不添加和添加1%SDS 组。综合各指标，在稀释液中添加1%SDS 对绵羊精液冷冻效果最佳。在绵羊冻融精子保护效果方面，SDS 与卵黄之间的剂量存在相关性，二者之间充分混合后具有协同作用。SDS 起的保护作用可能是通过卵黄间接实现的，经过SDS 乳化后的卵黄，分解出卵黄中更多的类脂物，这些类脂物更易进入精子质膜，从而更有效保护冻融精子的膜结构（参考文献略）。
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