非洲猪瘟病毒荧光PCR检测假阳性的原因与预防措施

现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2020/3/6 15:16:54 关注：616 评论： 我要投稿

  非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）荧光PCR检测是防控非洲猪瘟（ASF）的关键环节。江苏省动物疫病预防控制中心对两家具备ASF检测资质的实验室，进行了阳性样品复核，发现检测结果存在假阳性。为避免实验室检测中出现检测失误，本文分析了导致ASFV检测假阳性结果的原因：实验室检测功能区域设置以及人员、物品流向不合理；检测人员操作不规范、不熟练，未在独立的生物安全柜中进行样品提取与试剂配制；实验室通风不良、清洁消毒不彻底，样品或提取模板间产生交叉污染，PCR试剂、产物、阳性质粒发生污染。为此，从实验室结构、环境、操作等方面提出控制建议：严格实验室功能分区与管理，规范各种试验操作与流程，加强实验室通风和消毒，控制试验中产生PCR污染的相关因素；同时省级实验室要加强对基层实验室的培训、指导和监督，使其在ASF防控中发挥应有的关键作用。本文为从事ASF等重大动物疫病PCR检测的实验室，在提高检测结果准确性和可靠性方面提供了参考。
  非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度传染性疾病。该病病程短，死亡率高，对养猪业危害甚大，为世界动物卫生组织（OIE）规定须通报动物疫病，也是我国重点防控的一类动物疫病。2018年我国在辽宁省首次报告发现ASF疫情，随后其扩散蔓延到全国其他地区，给我国养猪业带来了极大经济损失。由于ASF的临床症状和病理变化很难与猪瘟等其他疫病区分，并且目前没有有效疫苗可用，因此快速准确的实验室诊断具有重要意义。经典的血吸附试验、病毒分离鉴定等检测诊断方法，对生物安全设施条件要求较高，在试验特异性以及检测时间等方面也有所限制。相比之下，荧光PCR具有较高的敏感性和特异性，可同时快速检测高通量样品，被广泛应用于ASF诊断和检测。
  目前，我国将荧光PCR作为ASFV实验室检测的主要方法，并且由农业农村部以及各省级兽医主管部门通过比对试验等考核方式，授权具备相应资质的兽医实验室开展ASFV实验室检测工作。江苏省动物疫病预防控制中心（以下简称疫控中心）作为农业农村部首批授权检测ASFV的兽医实验室，按照农业农村部统一要求，开展ASF确诊工作，并且组织省、市、县及第三方检测机构开展了ASF实验室检测比对，以及授权通过比对的实验室开展有关ASF检测工作。
  江苏省疫控中心对两家具备ASF检测资质的兽医实验室的28份荧光PCR 核酸阳性样品进行了复核，发现全为阴性。由此可见，尽管这两家兽医实验室都经过兽医主管部门组织的ASFV检测技术培训，并且通过了ASFV检测比对试验，获得了检测资质，但在实际检测中，仍不能完全保证检测结果的可靠性。
  本文结合走访调查及实验室工作经验，就导致ASFV检测假阳性结果的原因进行了系统分析并提出了相应的预防措施，以期为更多从事ASF等重大动物疫病检测工作的实验室及技术人员提供参考。
  主要原因
  检测功能区域设置不合理
  检测实验室没有严格按照PCR实验室设计要求，设置相对隔离的4个工作区域。有的实验室尽管分成了4个工作区间，但存在套间现象，比如4个工作区间的门通向同一个准备室，并不真正独立，没有形成有效隔离，并且普遍存在PCR检测区域与外部公共空间没有设置缓冲间的问题，导致PCR实验室与公共走廊没有形成有效隔离。
  人员流向、物品流向不合理
  根据PCR实验室建设要求，核酸提取区与核酸扩增区之间不应设置传递窗，以阻止扩增室中经过扩增的高浓度核酸片段以气溶胶等形式，经过传递窗回流到核酸提取区，造成污染。另外，有些检测人员没有严格按照“样品准备区→核酸提取区→核酸扩增区”的顺序定向移动，往往穿着同一套工作服从核酸扩增区又回到核酸提取区，造成人为核酸污染。
  样品提取与试剂配制未在独立的生物安全柜中进行按照PCR试验要求，试剂配制区应设有独立的实验室，如果不具备条件，也应该在样品提取区设置独立的生物安全柜，在生物安全柜中配制扩增反应体系。但有些检测人员往往忽视这一要求，在核酸扩增区配制扩增反应体系，配制结束后，PCR管盖不牢或者使用劣质的PCR管，导致扩增产物形成高浓度核酸气溶胶，造成扩增反应体系污染。
  检测人员操作不规范、不熟练
  不管是样品核酸提取环节，还是扩增体系配制环节，如果试验操作不规范，比如移液器操作不当，容易使移液器与不同试剂和样品之间发生交叉污染，而造成检测结果错误。
  试验结束后清洁消毒不彻底
  每次试验结束后，未对试验台、仪器设备等进行有效清洁与消毒，导致这些仪器设备表面残留的核酸片段，给下次试验造成潜在污染隐患。
  实验室通风设备运转不良
  有的实验室尽管设置了通风设备，但由于各种原因不能正常运转，造成实验室空气长期不流通，室内空气中累积大量含核酸片段的气溶胶，从而造成试验污染。
  样品或提取模板间交叉污染
  样品或模板放置时，由于密封不严而溢于容器外，造成不同样品或不同模板间产生交叉污染。
  PCR试剂、产物、阳性质粒污染
  试剂。PCR扩增体系配制过程中，未更换移液器枪头、试剂盖未倒置放置、混合用EP管未进行去酶处理、使用普通水稀释引物等均会造成试剂被样品核酸污染。
  产物。PCR扩增产物拷贝量大，扩增后的PCR管开盖等动作容易产生气溶胶，极微量的PCR产物，就可能造成试验污染。
  阳性质粒。ASFV荧光PCR检测试剂盒多使用克隆质粒作为阳性对照，而质粒在单位容积内浓度很高，如有操作不当，极易造成污染。
  预防措施
  实验室严格分区
  从事分子生物学检测与普通的血凝/血凝抑制（HA/HI）试验、酶联免疫吸附（ELISA）试验不同，微量的核酸污染即可严重影响试验结果的准确性。在设计分子生物学实验室时，必须按照分子生物学试验的具体要求，将实验室严格分隔成试剂配制区、核酸提取区、核酸扩增区、PCR产物分析区等完全独立的功能室，做到对互不相容活动的相邻试验区域形成真正有效的隔离（图1），防止交叉污染的发生。