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禽源性大肠杆菌对小白鼠致病性和治疗用药选择研究
李永光1，2，张栋栋2，张晓菊3，葛婷婷1，王丹丹1，寇新蕾1，何 健1，李莉莉1
(1.甘肃省定西市临洮农业学校，甘肃 临洮 730500；2. 甘肃农业大学应用技术学院，甘肃 临洮 730500；3. 临洮县洮阳镇畜牧兽医站 甘肃 临洮 730500))
摘 要：为研究禽源性大肠杆菌对动物的致病作用和家禽发生大肠杆菌病后治疗用药物的选择，本试验将禽源性大肠杆菌在37 ℃恒温震荡培养箱中培养16 h，随后选取10只普通级小白鼠，每只腹腔注射0.5 mL的培养菌液，3 d后剖检小白鼠，观察内脏器官变化，设计药敏试验，选取禽源性大肠杆菌敏感性药物。结果表明，被感染小白鼠的十二指肠水肿，肠内充满黄色内容物，肠壁变薄；药敏试验发现新霉素和多西环素对禽源性大肠杆菌具有明显的杀伤作用，可以作为家禽大肠杆菌病的治疗药物。
关键词：大肠杆菌；致病作用；药敏试验；治疗1885年，大肠杆菌首次被德国科学家Theodor Escherich在健康人的粪便中发现和分离。该菌为中等大小的肠杆菌，大小为1～3 μm×0.5～0.7 μm，单个或成双，无芽孢，大多数具有周身鞭毛，能运动，革兰氏染色阴性，需氧或兼性厌氧。大肠杆菌对营养的要求不高，适应性强，最适生长温度为37 ℃，最适pH为7.2～7.4。大肠杆菌在普通营养琼脂上生长良好，菌落形态为光滑、湿润、半透明、2～3 mm的灰白色菌落，在麦康凯琼脂培养基上形成红色菌落，在伊红美蓝琼脂培养基上形成黑色带金属光泽菌落[1]。
大肠杆菌广泛存在于动物的饲养舍、活动场所、动物体表等地方，以及饲料、饮水和动物粪便中，如在1 g动物粪便中约含有106个大肠肝菌。大肠杆菌为条件性致病菌，当人和动物机体在应激条件下或抵抗力减弱时，可导致胃肠道等多种器官出现病变，出现肠胃炎、腹痛、发热、腹泻等临床表现。在畜牧业的饲养生产中，大肠杆菌对动物(尤其是猪和鸡)的健康危害较大，每年由大肠杆菌引发的动物疾病(如禽大肠杆菌病、仔猪黄痢、仔猪白痢、断奶仔猪腹泻等)，给畜牧生产造成了巨大的经济损失。本研究通过将禽源性大肠杆菌经腹腔接种小白鼠，3 d后观察小白鼠的临床症状，随后剖检观察组织器官的变化，旨在观察禽源性大肠杆菌病的病理变化，为家禽大肠杆菌病的剖检诊断做好准备。与此同时，设计禽源性大肠杆菌药敏试验，探究多种抗生素对禽源性大肠杆菌的敏感性，为临床家禽大肠杆菌病治疗药物的选择做好理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物和禽源性大肠杆菌
试验用小白鼠购买于兰州大学实验动物中心，禽源性大肠杆菌菌种由甘肃农业大学动物医学院微生物实验室提供。
1.1.2 药物
试验所用的多西环素(DO30)、多粘菌素(PB300)、磺胺甲噁唑(SX25)、新霉素(N30)、羧苄西林(CB100)、万古霉素(YA30)均为从市场上正规商店购买的药品。
1.1.3 培养基
1.1.1.1 LB液体培养基
用电子天平称取胰蛋白胨1 g、酵母提取物0.5 g、氯化钠1 g，将它们放入200 mL的锥形瓶中，再加蒸馏水至100 mL，用pH计调节将液体的pH调至7.2，随后用高压蒸汽灭菌器灭菌后备用。
1.1.1.2 LB固体平板培养基
用电子天平称取琼脂粉1.5 g，加入至 100 mL LB液体培养基中，高压蒸汽灭菌器高压灭菌，灭菌后置于超净工作台中，待温度降至50～60 ℃时，倒置溶菌肉汤(lysogeny broth，LB)固体平板培养基，冷却后置于4 ℃冰箱备用。
1.1.1.3 伊红美兰琼脂培养基
用电子天平称称伊红美兰琼脂5 g，随后放入200 mL的锥形瓶中，加蒸馏水至100 mL，经高压蒸汽灭菌器高压灭菌，灭菌后置于超净工作台中，待温度降至50～60 ℃时，倒置伊红美兰琼脂平板，冷却后置于4 ℃冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1 大肠杆菌的培养
1.2.1.1 大肠杆菌接种
在超净工作台中将禽源性大肠杆菌菌种接种于LB培养基。
1.2.1.2 大肠杆菌培养
将接种了禽源性大肠杆菌菌种的LB培养基置于37 ℃恒温震荡培养箱中培养12～16 h。检测菌悬液浓度为7.2×108 CFU/mL。
1.2.2 小白鼠的接种与剖解
取10只小白鼠，每只灌服过夜培养的禽源性大肠杆菌菌液0.5 mL，接种后置于动物房单独饲养，并观察它们的死亡情况和临床变化。3 d后，对未死亡小白鼠进行颈部脱臼致死，经75％酒精浸泡消毒后，然后固定于小动物剖检台上，在酒精灯火焰10 cm范围内剖检，眼科镊子轻轻提起小白鼠腹壁，眼科剪剪开腹壁，观察腹壁下是否出血。然后打开腹腔，逐个观察腹腔内肝脏、胃、肠、脾脏等器官的病理变化。打开胸腔，观察胸腔内肺脏和心脏的病理变化。
1.2.3 大肠杆菌鉴定
眼科剪刀经灼烧消毒，消毒小白鼠肝脏病变部位表面，剪开病变部位，酒精灯火焰灼烧接种环，蘸取病变部位划线接种于伊红美兰琼脂培养基，37 ℃恒温培养箱内倒置培养，鉴定病原是否为大肠杆菌。
1.2.4 药敏试验
提前30 min取出LB固体平板培养基置于超净工作台内，吸取1 mL禽源性大肠杆菌菌液，用涂布棒将菌液均匀涂布于LB固体平板培养基上，将多西环素(DO30)、多粘菌素(PB300)、磺胺甲噁唑(SX25)、新霉素(N30)、羧苄西林(CB100)、万古霉素(YA30)等药敏片均匀贴置于平板内，37 ℃恒温培养箱内，观察各种抗菌药对大肠杆菌的抑杀作用，为大肠杆菌病的治疗选药做参考。
2 研究结果
2.1 小白鼠感染禽源性大肠杆菌后病变
2.1.1 外观变化
在10只接种禽源性大肠杆菌菌液的实验小白鼠中，死亡6只，死亡率达60％；剩余4只精神萎靡，被毛粗乱，食欲下降，个别眼睑粘连。
2.1.2 病理剖检变化
剖检发现，大部分小白鼠的肝脏肿大，肝脏表面有点状或斑块状出血；个别小白鼠胃部膨大，充满内容物；十二指肠水肿，肠壁变薄，肠内充满淡黄色的内容物。脾脏充血肿大，边缘呈暗紫色；肾脏略肿大，颜色变深；心脏、肺脏等其他脏器未见明显异常。小白鼠病变主要在肝脏和小肠，临床上动物感染大肠杆菌病后主要表现为腹泻等肠道炎症(图1)。
2.2 大肠杆菌感染验证结果
用接种环挑取感染小白鼠病变部位，用划线方式接种于伊红美兰琼脂培养基，37 ℃恒温培养16 h后，生长出黑色带金属光泽的圆形菌落，证明小白鼠病变部位的病原菌为大肠杆菌，根据科赫法则可以推断小白鼠的病变是由大肠杆菌导致的(图2)。
2.3 药敏试验结果
根据多西环素(DO30)、多粘菌素(PB300)、磺胺甲噁唑(SX25)、新霉素(N30)、羧苄西林(CB100)、万古霉素(YA30)等药敏片对涂布于LB固体平板培养基上的禽源性大肠杆菌的抑菌圈直径大小，判断出禽源性大肠杆菌对多种抗菌药的敏感程度，为临床上家禽大肠杆菌病选取高效的治疗药物(图3、表1)。
新霉素(N30)对禽源性大肠杆菌的抑菌圈直径为21 mm，大于20 mm；多粘菌素对禽源性大肠杆菌的抑菌圈直径为15 mm，大于9 mm，按照药敏试验判定标准，判定出禽源性大肠杆菌对此两种抗菌药物超级敏感，临床上可以选用新霉素和多粘菌素治疗禽源性大肠杆菌引起的动物疾病，理论上会有较好的治疗效果。其他4种抗菌药的抑菌圈直径为均为0，证明这4种抗菌药对禽源性大肠杆菌无任何抑制和杀灭效果，临床上不能用来治疗禽源性大肠杆菌引起的疾病。
3 结论与讨论
对大肠杆菌的不同分离株采用不同接种途径，被感染小白鼠会表现出不同的临床症状和死亡率。本实验通过腹腔注射接种途径，给10只小白鼠接种甘肃农业大学实验室保存的禽源性大肠杆菌，结果死亡率高达60％，存活小白鼠表现为精神萎靡，出现较严重的症状；李基棕等[2]研究发现，猪场环境中的大肠杆菌对小白鼠的致死率高达51.3％，其中污水和空气中的大肠杆菌菌株对小白鼠的致死率最高达66.7％；陈亢川等[3]对从人体和动物体中分离到的7株O157大肠杆菌在实验室中进行大量培养，随后采用腹腔接种的方式感染小白鼠，结果接种的小白鼠均出现严重的临床症状；海岩等[4]用从患有乳房炎的奶牛中分离到的大肠杆菌经腹腔接种小白鼠，致死率为81.8％；赵素微等[5]用从乳腺炎患病牛中分离的大肠杆菌菌株经腹腔接种小白鼠，致病率高达90％；但是在文献报道中，Isogai等将肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC) O157:H7-EDL 931株和7号株经口腔灌服IQI小鼠，剖检发现胃肠道无组织学病变[6]。
在药敏试验中，对大肠杆菌具有较好抑杀作用的药物包括新霉素和多粘菌素。新霉素对大肠埃希菌以及克雷伯菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、布鲁菌属等革兰氏阴性菌有较强的杀伤效果，杀菌原理是其能够结合细菌核糖体30 S亚单位，抑制细菌蛋白质的合成。但是，革兰氏阴性菌与新霉素接触后极易产生耐药性，从而使后者失去杀菌作用，临床上可采用交替用药和联合用药的方式使用新霉素与庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素等氨基糖苷类抗生素，以减少或延缓细菌耐药性的产生。多黏菌素为多肽类抗生素，由多黏类芽孢杆菌产生，临床上对大肠杆菌、肺炎杆菌、绿脓杆菌等革兰氏阴性菌所致感染有较好治疗效果。
本试验初步建立了禽源性大肠杆菌感染小白鼠模型，通过药敏试验找到了大肠杆菌敏感药物，为临床大肠杆菌性疾病的诊断、治疗和防制提供理论支持。
参考文献
[1] 陆承平．兽医微生物学(第5版)[M]．北京：中国农业出版社，2013.
[2] 李基棕，周碧君，王开功，等．猪场环境大肠杆菌对小白鼠的致病性研究[J]．贵州农业科学，2011，39(6)：147-149.
[3] 陈亢川，郭维植，程法稷，等．福建省O157大肠杆菌调查[J]．中华预防医学杂志，2000，34(3)：156-158.
[4] 海岩．内蒙地区奶牛环境性乳房炎主要病原菌的分离鉴定及克雷伯氏菌的基因分型[D]．呼和浩特：内蒙古农业大学，2007.
[5] 赵素微．奶牛乳腺炎主要病原菌致病性及其免疫原性研究[D]．呼和浩特：内蒙古农业大学，2008.
[6] EMIKO, ISOGAI, HIROSHI, et al. Effect of Antibiotics, Levofloxacin and Fosfomycin, on a Mouse Model with Escherichia coli O157 Infection[J]. Microbiology and Immunology, 2000, 44(2): 89-95.
作者简介：李永光(1982－ )，男，预防兽医学硕士研究生，高级讲师，主要从事畜牧兽医专业教学与研究工作；E-mail：3646717@qq.com
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