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为了研究腹水综合征（AS）肉鸡肝脏缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的表达与肌成纤维细胞（MFB）数量变化之间的关系，本试验采集5只10周龄AS肉鸡及5只健康肉鸡肝脏，切取一部分以10%的福尔马林固定，大部分置于-80℃冰箱保存，采用石蜡切片技术进行HE染色及免疫组化技术对肉鸡肝脏进行显微结构和α-SMA蛋白的表达及分布情况的观察，用qRT-PCR技术对HIF-1α基因进行检测。结果显示：AS肉鸡肝脏结构排列松散，HIF-1α基因表达极显著(P<0.01),α-SMA蛋白含量表达显著（P<0.05）。本试验结果表明：腹水肉鸡肝脏HIF-1α基因含量表达及α-SMA蛋白含量表达相比健康肝脏均显著增多，肝星状细胞被HIF-1α基因刺激激活，合成分泌α-SMA蛋白，进而转化为具有增生性和纤维原性的MFB细胞，HIF-1α基因的表达量与MFB细胞的增多成正比。
关键词：肉鸡;腹水综合征;HIF-1α;α-SMA;MFB;肝脏;纤维化;肉鸡腹水综合征（ascites syndrome,AS）是缺氧引起的以腹水、肺脏动脉高压和右心衰竭为主要特征的临床综合征[1]。AS肉鸡剖检显示肝脏充血肿大或皱缩，表面凹凸不平，颜色多呈暗红色，常有棕黄色沉积物，肝脏周围有淡黄色或灰白色胶冻状凝块附着，肝静脉和门静脉怒张充血[2]。AS肉鸡心脏功能不全导致肝脏缺乏有效的循环血量和供氧，加重肝损伤最终发生纤维化，引起腹水。缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)作为在缺氧条件下主要的调节因子起着关键作用[3][9]，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是HIF-1主要的氧调节亚基，决定其水平及活性。肝纤维化是多种原因引起的反复和慢性肝损伤造成细胞外基质(extracellular matrix,ECM)积累的病理现象。目前研究认为，肝纤维化的ECM主要由肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)合成[4],HSC在肝纤维化的发生、发展和逆转过程中起至关重要的作用[5]。当肝脏受到损伤时，HSC表型会发生变化，通过激活α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)转化为肌成纤维细胞（MFB），生成大量ECM[6,10]。试验通过对AS肉鸡肝组织中α-SMA蛋白的表达量进行测定，进而观察出MFB细胞分布的数量，同时对HIF-1α基因表达含量进行测定，初步探索AS肉鸡肝脏HIF-1α基因的表达与MFB细胞数量的变化关系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验所用鸡采集于新疆阿克苏市郊某肉鸡养殖场，为10周龄健康肉鸡和AS肉鸡。
主要试剂：平滑肌肌动蛋白多克隆抗体兔抗鸡一抗、免疫显色试剂Poly-HRP羊抗小鼠/兔二抗试剂购自武汉三鹰生物技术有限公司，苏木素、伊红、0.01M柠檬酸钠缓冲试剂（p H6.0）购自北京索莱宝科技有限公司，HIF-1α抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，HRP-DAB底物显色试剂盒购自天根生化科技有限公司，（Trans Zol Up Plus RNA Kit)RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、Green q PCR Super Mix试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
主要仪器：石蜡包埋机（EG1150）、手动切片机（RM2125）购自Leica德国，生物显微镜（尼康E200）购自尼康江南光学仪器有限公司，实时荧光定量PCR仪Quant Studio 5购自美国默飞世尔科技公司，梯度PCR仪TC-5000购自法国TECHNE。
1.2 试验方法
1.2.1 样本的采集和保存
取5只10周龄肝脏腹水肉鸡和5只10周龄健康肉鸡的肝脏组织样本，一部分以10%的福尔马林固定；另一半置于-80℃冰箱保存。
1.2.2 肝脏的显微结构特征观察
10%福尔马林固定的样品，经石蜡包埋，切取5μm厚度切片放置60℃恒温箱烘烤1 h，经二甲苯脱蜡、梯度酒精复水、苏木精-伊红染色后，再经梯度酒精脱水后用中性树胶封片，通过光学显微镜观察肝脏结构的微细结构变化。
1.2.3 利用免疫组化研究肌成纤维细胞的分布
烤片：将已完成的切片在60℃条件下烘烤1 h。
脱蜡：将烘干后的切片在二甲苯溶液中脱蜡两次，每次约10 min。
梯度水化：将浸泡后的切片依次置于无水酒精、95%、85%、75%酒精溶液中浸泡，每一次均约5 min，最后将切片置于蒸馏水中漂洗约5 min。
热修复抗原：取枸橼酸盐缓冲液0.01M，将漂洗后的切片浸入，并置于微波炉中加热，沸腾后断电，10 min后再次低火煮15 min，静置待其冷却后用p H为7.2～7.6的PBS冲洗3次，每次约3 min。
阻断：每张切片加50μL 3%过氧化氢溶液，放置约15 min以使内源性酶失去活性，PBS洗涤3次，每次约5 min。
孵育一抗：向切片上滴加一抗（smooth muscle actin Polyclonal antibody），并置于4℃冰箱中，12 h后取出切片，经PBS洗涤3次，每次5 min。
孵育二抗：滴加50～100μL免疫显色试剂Poly-HRP羊抗小鼠/兔二抗试剂，37℃烤箱中放置30 min,PBS液洗涤3次，每次5 min。
DAB显色：滴加预制好的DAB工作液50～100μL,5 min后镜下观察染色情况并控制反应时间，染色后用蒸馏水洗涤。
苏木素染液浸染5 min，用蒸馏水洗涤后，经PBS返蓝。
梯度溶液(60%～100%)脱水，每级约5 min。取出后将切片置于二甲苯溶液中处理两次，每次约10 min，最后滴加中性树胶封片[7]。通过光学显微镜观察a-SMA蛋白在腹水肉鸡肝脏中不同部位的分布和比例。注：以PBS代为一抗作为阴性对照。
1.2.4 HIF-1α的表达及蛋白含量检测
引物设计：HIF-1α引物参照韩烨晨等的报道[8],GAPDH通过Primer Premier 5.0软件进行引物设计，由上海生工合成。
肝组织RNA的提取：使用RNA提取试剂盒(Trans Zol法)进行提取，并用Nanodrop测定RNA浓度。
肝组织RNA的反转录：用Two-Step反转录试剂盒合成c DNA；依次加入Total RNA 1μL、Anchored Oligo(d T)18 Primer(0.5μg/μL) 1μL、2x ES Reaction Mix 10μL、Easy Script?RT/RI Enzyme Mix 1μL,g DNA Remover 1μL、RNasefree Water 6μL，总体积20μL。将20μL体系放于PCR仪中反应15 min(42℃），85℃加热5 s，产物于-20℃保存。
实时荧光定量PCR：将反转录产物c DNA浓度稀释10倍，取稀释后c DNA,Green q PCR Super Mix试剂盒说明书进行操作。依次加入c DNA1μL、Forward Primer 0.4μL、Reverse Primer 0.4μL、2x Perfect Start?Green q PCR Super Mix 10μL、RNase-free Water 8.2μL，总体积20μL。反应条件为：95℃30s;95℃15 s;60℃30 s；溶解曲线为95℃15 s;60℃1 min;95℃1 s;40个循环，每个样品做三个生物学重复试验，根据每个样品的Ct值用2-ΔΔCt公式计算HIF-1α的m RNA在腹水肉鸡肝脏中的相对表达量。HIF-1α基因引物序列见表1。
1.2.5 数据分析
q RT-PCR用Graph Pad Prism8.0作图，免疫组化用Image J 1.8.0进行分析。数据用SPSS22.0软件进行分析，结果以“X±S”表示，以P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 肝脏的HE染色
结果显示如图1。与健康肉鸡肝组织（图1A）相比，腹水肉鸡肝组织（图1B）完全失去正常结构，肝索排列松散，部分正常肝细胞结构被破坏；肝血窦变大并淤血。出现部分炎性细胞及成纤维细胞。
2.2 肝脏α-SMA的表达量
结果显示如图2。与对照组相比，腹水组α-SMA表达更明显。对肝脏组织进行阳性面积测定，结果显示腹水组（图2B）阳性面积比值是（12.70±1.65）%，健康组（图2A）为（0.54±0.36）%，差异显著（P<0.05）。
2.3 HIF-1α的表达量
结果如图3。q RT-PCR结果显示，HIF-1α在腹水肉鸡肝脏差异表达极显著(P<0.01)。
3 讨论
研究表明，患有腹水综合征的肉鸡肝脏损伤严重[15]。HIF-1α是在于哺乳动物细胞质内的转录因子，也是引发AS肉鸡的关键因子[16]，在低氧环境中，HIF-1α在细胞内积聚并与HIF-1β结合形成HIF-1,HIF-1与缺氧反应原件（HRE)结合，参与多条信号转导通路，引起细胞对缺氧的反应[17]。在本试验中，腹水肉鸡肝脏HE染色显示肝组织完全失去正常结构，肝索排列松散，部分正常肝细胞结构被破坏；肝血窦变大并淤血，与健康肉鸡肝脏显微结构差异明显，与李凯的研究结果一致[14]。肉鸡腹水综合征是一种由遗传、营养[18]、环境[19]等多因素导致的营养代谢病，但是缺氧是腹水肉鸡发病的重要因素[20]。前期研究表明，AS肉鸡剖检显示肝脏充血肿大或皱缩，表面凹凸不平，颜色多呈暗红色，常有棕黄色沉积物，肝脏周围有淡黄色或灰白色胶冻状凝块附着，肝静脉和门静脉怒张充血[2]。这是因为AS肉鸡心脏功能不全，继而导致肝脏缺乏有效的循环血量和供氧，加重肝损伤，最终发生纤维化，引起腹水。q RT-PCR结果显示腹水肉鸡的肝脏中HIF-α基因表达极显著(P<0.01)高于健康肉鸡，说明在低氧环境中，肉鸡体内HIF-1α被激活。肝星状细胞（HSC）在肝纤维化过程中起着重要作用，正常为静息状态，当受到外界因子刺激时，合成分泌平滑肌动蛋白（α-SMA）进而转化为肌成纤维细胞（MFB)[11][12]，因此，MFB水平的变化与肝脏纤维化水平呈正相关。本研究结果显示，腹水肉鸡肝脏α-SMA蛋白含量表达显著（P<0.05）高于健康肉鸡，与韩烁晨的研究结果一致[13]，这表明在AS发病过程中，MFB参与肝脏的纤维化形成。
4 结论
在AS肉鸡形成的过程中，HIF-α表达均持续升高，肝星状细胞被HIF-1α基因刺激激活，合成分泌α-SMA蛋白，进而成为具有增生性和纤维原性的MFB，导致细胞外基质过度沉积，器官纤维化形成。腹水肉鸡肝脏HIF-α含量及α-SMA含量表达均显著高于健康肉鸡(P<0.01,P<0.05)，且HIF-1α基因的表达量与MFB细胞的增多成正比。
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