禽流感实验室检测技术方案

现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2016/4/22 9:05:09 关注：504 评论： 我要投稿

　　禽流感是由正粘病毒科流感病毒属中的A 型流感病毒引起的、发生于各种家禽和野禽的病毒性传染病。该病1878 年在意大利鸡群中首次爆发，目前已遍布世界许多国家。世界各地的高致病性禽流感主要由H5 和H7 亚型禽流感病毒引起，是人畜共患病，不仅能给养禽业带来毁灭性打击，还严重影响人类健康。高致病性禽流感因其传播快、危害大，被世界动物卫生组织（OIE）列为A 类疾病，我国将其列为一类动物疫病。
　　一旦在活禽或禽肉产品中检出高致病性禽流感，将直接影响活禽及其相关产品的贸易，并造成恶劣的国际影响。而目前我国年饲养肉鸡已达25亿只，加工冻鸡产品600多万吨，占世界产量的15%。我国已成为居美国之后的第二大鸡肉生产国，禽肉每年出口50多万吨，创汇近9亿美元。
　　禽流感亚型众多加上基因突变、重组和重排，使其变异极快，导致毒株的致病性也千差万别，早期快速诊断和血清学监测无疑是预防、控制禽流感的前提条件。随着血清学实验技术和分子生物学技术的飞速发展，目前在检验检疫，疾病控制，农业及畜牧业领域，禽流感诊断技术的研究也不断取得新的进展。
　　早期血清学诊断技术
　　琼脂扩散（AGP）试验进行病毒抗原型特异性鉴定用已知阳性血清和未知抗原进行AGP试验。受检样品是具有血凝素活性的鸡胚尿囊液。AGP是用来检测A型流感病毒群特异性血清抗体，即抗核糖蛋白（KNP）基质蛋白（MP）抗体，因而适用于鉴定流感病毒。1979年Beard首次将AGP用于食流感抗体的检测。此法虽然简单易行，但是敏感性较差，易出现假阳性。
　　血凝试验(HA)和血凝抑制试验（HI）
　　血凝素(HA)是由3条糖基化多肽分子以非共价形式聚合而成的三聚体，其C末端有一疏水区插入病毒囊膜的双层脂质膜中，是与病毒囊膜的结合部位。N末端有一疏水区，具有膜融合活性，对病毒侵入宿主细胞是必须的。HA能与多种动物（如鸡、豚鼠）和人的红细胞表面的糖蛋白受体相结合，引起红细胞凝集，我们把这种现象叫血凝。若在病毒与细胞混合前先加抗血凝素抗体，使该抗体首先与病毒血凝素结合，当再加入红细胞时，由于病毒血凝集上结合的抗体的阻断作用，血凝素就不能再与红细胞上的受体结合，红细胞就不出现凝集，这种现象我们称为血凝抑制。血凝和血凝抑制，是病毒学研究常用的检测指标。一般情况下，新分离毒株要先鉴定出特异性NP或MP抗原型（用AGP）确定禽流感病毒，再做HA亚型的鉴定。HA、HI特异性好，是亚型鉴定的常用方法，但其操作过程繁琐费时，并且由于用已知HA亚型的抗血清不能检出新的HA亚型的禽流感病毒，所以用该方法鉴定不如琼脂扩散实验简便和快捷。
　　神经氨酸酶促试验
　　检测是在Endogenous Viral-encoded Enzyme Assay (EVEA)的基础上建立起来的。利用禽流感病毒的糖蛋白神经氨酸酶与底物的反应来检测病毒的存在与否。美国DNC公司的ZstatFlu人间禽流感快速诊断试剂盒采用简单的4步法，在20分钟内检测A型和B型流感病毒。神经氨酸酶可以水解含有N－乙酰神经氨酸（Neu5Ac）的底物，ZstatFlu试剂盒中使用的底物是经过改造的Neu5Ac，带有色原体，反应之后，底物上连接的色原体被水解下来，并发生凝聚而生成蓝色物质。因此通过最终的颜色变化，可以鉴定出流感病毒的存在。由于神经氨酸酶的活性位点在禽流感病毒中十分的保守，因此ZstatFlu检测的结果十分可靠，不会由于病毒的变异造成漏检。检测特异性高达99%。
　　中和试验（NT）
　　用中和试验（NT）来鉴定或滴定流感病毒时，常用鸡胚或组织培养细胞，操作方法与其他病毒（如NDV）的中和试验相同。NT试验是最敏感而特异的血清学方法，只有抗体与病毒颗粒上的表面抗原相对应，特别是与吸附到宿主细胞上的病毒表面抗原相对应，才能在实验中取得满意的显示效果。因此，某一个血清型的中和实验机体只与同组内的其他病原表现出有限的交叉反应。病毒中和实验操作繁琐耗时费料，临床上几乎不用。但作为经典方法在病毒鉴定中起着重要作用，许多新的检测方法都要以此作为标准进行比较。
　　酶联免疫吸附法（ELISA）
　　Meulemans（1987）对ELISA．AGP，HI检测AIV抗体进行了比较研究，发现 AGP和 ELISA一样均能检测型特异性抗原（抗体），但敏感性远低于ELISA，HI适用于亚型的检测，其敏感性不如ELISA。1993年，Shodihall用混合纤维素脂膜或硝酸纤维素膜代替微量反应板，建立了快速诊断的DAS～ELISA，大大缩短了诊断时间，并可保留ELISA的特异性、敏感性，其结果又不需要特殊仪器分析，可用肉眼判定。随着分子生物学技术的发展，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所用表达禽流感病毒核蛋白的杆状病毒感染昆虫细胞，以其表达产物制备抗原，建立了以杆状病毒系统表达的AIV核蛋白为抗原的禽流感间接（重组核蛋白）ELISA诊断技术（rNP－ELISA，确定了其最适工作条件，并对3138份鸡血清进行了检测，实验证明，rNP－ELISA与全病毒间接ELISA（AIV－ELISA），AGP及HI的符合率分别为99.9％，97.1％，98.8％,并能100％检出AGP阳性及疑似HI阳性的血清样品，这证明了rNP－ELISA是检测A型禽流感病毒血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量。快捷、经济的血清学诊断技术。
　　现在市场上也出现了很多商业化的ELISA试剂盒，如IDEXX公司的家禽禽流感ELISA检测试剂盒。专为检测鸡血清中禽流感抗体而设计的试剂盒，可在两个小时之内完成96个样品的检测。此试剂盒不但操作简便，而且检测结果十分可靠，与传统的琼脂扩散法（AGP）和血凝抑制试验的吻合程度高达98%。
　　免疫荧光技术（IFT）
　　免疫荧光技术就是荧光抗体技术（FAT）。IFT早在1961年就开始用于人类流感的快速诊断。1984年美国宾西法尼亚州爆发禽流感时Skeeles将IFT首次用于AIV的检测。IFT最早用于病毒的鉴定和定位病毒感染细胞中特异性抗原，主要是核内荧光；用MP抗原的荧光抗体主要出现胞质荧光，核内也有部分荧光。用于禽流感病毒的诊断常用直接荧光抗体法，即在组织切片上直接染色，以荧光显微镜检查荧光，一种AIV的荧光抗体可用来检测不同亚型的其他病毒。IFT用于诊断具有快速、简便、敏感性好的特点，而且费用较低。其敏感度同病毒的分离鉴定相当，有时高于用鸡胚进行的病毒分离。但是需要注意的是如何避免和降低标本中出现的假阳性）问题。间接免疫荧光技术也可以用来检测核蛋白（NP）基质蛋白（MP）抗原与抗体的反应，其敏感性很高。但对抗原制备要求较高，需用非离子型去污剂对纯化的病毒粒子进行裂解。
　　新兴分子生物学诊断技术
　　常规血清学诊断技术由于历史悠久，对技术要求相对较低，仍是目前世界上采用比较广的方法。但它们不能为疾病作出早期、明确的诊断，有的在准确度，标准化等方面还有较大的缺陷。而新兴的分子生物学诊断技术在这方面有了明显的突破。我们知道，基因存在于人体细胞核内，基因组核酸作为生命的遗传物质，生命的物质基础——很多疾病都是由于基因的改变，导致各种表型的改变，进而引起疾病的发生；很多致病原如病毒，也是通过其基因组核酸的导入引起了宿主生物体内的一系列致病反应。分子生物学诊断技术能从分子水平，如基因组核酸揭示多种疾病，如高致病性禽流感，甚至潜在高致病性禽流感毒株的差异，为疾病作出早期而快速的诊断。荧光定量PCR技术就能在基因水平灵敏、特异和快捷准确的检测禽流感病毒。
　　荧光定量PCR（RT-PCR）
　　近几年发展起来的荧光定量RT-PCR分子诊断技术，配合荧光定量PCR仪可以从基因水平检测禽流感RNA基因，具有高度的敏感性和特异性，并且可大大地缩短对AI病毒的检出时间，克服了传统的禽流感诊断技术包括病毒分离鉴定试验周期长的缺点，为禽流感早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的检测 方法。目前，我国通过设计合成AIV核蛋白（NP）基因特异的引物，建立了可以直接从临床病料的感染组织中检测所有亚型禽流感病毒的。RT-PCR诊断技术经试验表明，可应用于对所有亚型禽流感感染的早期快速诊断，具有敏感、特异、快速的特点；另外，为特异、快速地检出可引起高致病力禽流感大爆发的H5或H7亚型禽流感病毒的感染，通过对比禽流感病毒血凝素基因保守序列，设计了特异性引物,建立了对临床病料或鸡胚接种物中H5和H7亚型禽流感病毒进行快速分型检测RT-PCR诊断技术；此外，H5和H7亚 型禽流感病毒分子分型诊断技术在特异地检出H5或H7亚型禽流感病毒感染的同时，还可根据应用特定引物经RT-PCR扩增出的H5和H7包括裂解位点在内的HA基因片段，经测序推导出的氨基酸序列来判断H5或H7亚型禽流感病毒的致病性高低，在为我国禽流感尤其是高致病力禽流感的防制提供先进、有效的早期快速诊断技术和监测手段的同时，也为高致病力禽流感防制 争取到极为宝贵的快速反应时间。
　　在技术流程方面，主要包括样本采集和制备，反应体系准备，荧光定量PCR反应及检测等几个部分。对禽流感、SARS这样的滴度比较低的核酸病毒致病原，病毒核酸纯化的质量和产量对后续的检测结果至关重要，世界核酸纯化第一品牌德国QIAGEN公司提供完整的产品线，包括全自动核酸纯化系统，高效病毒纯化试剂盒以及RT-PCR试剂盒。该公司的病毒纯化与RT-PCR试剂盒在去年的非典型性肺炎/严重急性呼吸道症候群的病原体检测及研究中发挥了重要的作用，被全球众多疾病控制中心及相关机构广泛使用，因而也被国内多家权威机构强力推荐用于禽流感等多种病毒性传染病的检测及诊断。该技术的核心是定量PCR反应，需要专用的定量PCR设备，Roter Gene 3000（Corbett Research公司）就是一款可用于疾病检测及诊断的理想的荧光定量PCR仪，它有四个荧光通道，适合几乎市面上常用的所有荧光染料的检测。其独特的离心式设计保证了超凡的温度均一性，极高的灵敏度及极佳的重复性确保了检测结果的可靠性。此外，它还有配套的CAS－1200 PCR反应自动加样系统，可实现自动、高速、标准化的PCR反应加样过程，其全封闭的操作平台既可避免样品污染，又保证了操作者的安全。
　　依赖核酸序列的扩增技术
　　NASBA（Nucleic acid sequence-based amplification ,NASBA，依赖核酸序列的扩增技术）是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术使用三种酶（反转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7 核糖核酸聚合酶）和两条寡核苷酸引物。在扩增步骤中，两个5’端都整合进扩增序列中，这样既成为产生互补RNA 序列的模板，又能特异性结合检测步骤中的ECL 探针。扩增底物与ECL 探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学(electrochemistry)发光（ECL）反应。已杂交上的钌标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA 扩增产物总量成比例对应。依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）检测禽流感病毒的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当，并具有检测速度快、特异性强、易于操作的特点，为主管部门确定疫情和采取防范措施争取了宝贵的时间。