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摘要：2021年4月6日，辽宁省沈阳市和平区长白岛森林公园内饲养的10只黑天鹅和1只大雁死亡，袭击率为3.8%（11/291）。经现场调查和临床剖检诊断，市级和省级疫病控制中心实验室检测，诊断为疑似H5亚型高致病性禽流感。随后，经国家禽流感参考实验室确诊为H5N6亚型高致病性禽流感。4月12日，农业农村部公布了该起疫情。在接到疫情报告后，辽宁省农业农村厅立即组织紧急流行病学调查组，采用现地察看、座谈、问卷调查、实验室检测等方式，对疫情发生情况进行调查，追溯疫情来源，追踪疫情扩散风险，并提出针对性防控措施。经综合判定，疫情由迁徙候鸟带毒传入引发的可能性较大；未开展禽流感免疫接种，未建立起有效的免疫保护屏障，是此次疫情发生的内因。经科学处置，疫情被扑灭，扩散风险低。疫情启示，扎实做好公园、动物园等观赏野禽饲养相关场所的禽流感强制免疫工作，切实筑牢野禽及家禽禽流感免疫保护屏障，对降低禽流感疫情发生风险具有重要意义。
自1997年我国香港禽流感病毒感染人事件发生以来，人感染禽流感病毒病例时有发现，禽流感病毒逐渐成为重要的人兽共患病病原体。已有文献报道，感染人的禽流感病毒有多个亚型，包括H5Ny（y = 1，6）、H9N2、H7Ny（y = 2，3，7，9）、H4N8、H6N1和H10Ny（y = 7，8）等，其中高致病性禽流感病毒主要在H5和H7亚型中被发现。
自2008年以来，在我国陆续监测到Clade 2.3.4分支的新型亚洲来源（Goose/Guangdong系）H5Ny（y = 2，5，6，8）亚型高致病性禽流感病毒，其逐渐进化成遗传学上独立的4个亚分支Clade 2.3.4.4 A—D。2013年，H5N6亚型禽流感病毒在我国引发疫情，并从2014年开始，逐渐取代H5N1亚型，成为我国家禽和活禽市场中流行的主要亚型，并在野生和家养水禽、陆养家禽、鸽子以及猪和猫体内均被分离到。2014年四川省报道首例人感染H5N6亚型高致病性流感病毒的重症死亡病例。截至2021年5月底，我国共发现25例人感染H5N6亚型高致病性流感病毒病例。与人感染H5N1亚型流感病毒的病死率52.8%和H7N9亚型流感病毒的病死率39.2%相比，人感染H5N6亚型流感病毒的病死率更高，达到64%。近年来，中国疾病预防控制中心流感研究团队经过动物感染试验发现，一些禽源H5N6亚型流感病毒株能够结合人源受体，且在雪貂感染模型中的传播能力强于H5N1亚型流感病毒，提示H5N6亚型流感病毒可能会成为未来严重威胁公共卫生安全的重要病原，应引起高度重视。
2021年4月8日，沈阳市农业农村局接到和平区市场监管事务服务与行政执法中心负责人报告，该区内长白岛森林公园自4月6日开始出现黑天鹅发病死亡情况，截至4月8日报告时，已发病死亡11只。沈阳市农业农村局接到报告后，立即组织市、县相关专家进行现场调查、临床剖检诊断，怀疑为流感疫情。现场采集病死黑天鹅组织、粪便等样品进行实验室检测。4月9日经沈阳市动物疫病预防控制中心（以下简称“沈阳市疫控中心”）检测，结果为H5亚型流感病毒核酸阳性，4月10日经辽宁省农业发展服务中心兽医实验室（原辽宁省动物疫病预防控制中心，以下简称“辽宁省疫控中心”）复核，结果一致，遂于当日将阳性样品送至哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室进行检测确诊分析。与此同时，辽宁省农业农村厅组织省市联合流行病学调查组，赴现场开展紧急流行病学调查，对疫情发生情况进行核实、溯源和追踪，对疫情扩散风险进行评估，并现场指导开展疫情处置扑灭工作。4月12日，农业农村部公布了该起野禽H5N6亚型高致病性流感疫情。
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病例定义
临床怀疑病例
2021年3月17日以来，沈阳市长白岛森林公园内饲养的野禽及沈阳市各区县内家禽养殖场户、公园、动物园、野鸟栖息地、花鸟市场等相关场所的家禽、野禽中，出现精神沉郁、厌食、神经症状或不明原因急性死亡的病例。
疑似病例
临床怀疑病例经沈阳市疫控中心实验室使用禽流感通用荧光RT-PCR方法检测为阳性，并经禽流感病毒分型荧光RT-PCR方法检测为H5亚型流感病毒核酸阳性，且与辽宁省疫控中心复核结果一致的病例。
确诊病例
国家禽流感参考实验室经病毒分离鉴定及测序分析，确诊为H5N6亚型流感病原学阳性的疑似病例。
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调查方法
现场调查
采用现场查勘、访谈和问卷调查等方式，对该森林公园内饲养野禽的种类、数量、栖息场所、饲养管理方式以及禽流感免疫、禽只调入及调出、其他野生动物饲养管理等进行调查；通过与该区农业农村局、市场监管事务服务与行政执法中心相关人员座谈，掌握疫点周边禽类养殖场户、禽交易市场等场所的分布情况，调查了解疫点周边地区及全省范围内的候鸟迁徙路线、留鸟活动等相关情况。
临床观察及剖检
对公园内饲养的所有野禽进行临床观察，对最近死亡野禽进行剖检，观察病理变化。
样品采集
2021年4月8日，采集长白岛森林公园内当天病死的黑天鹅组织样品2份、活动场所新鲜野禽粪便6份，环境水样、土壤、饲料各3份，共17份样品；4月10日至5月1日，在全市范围内针对性采集禽饲养场户、活禽交易场点、禽屠宰场、公园、花鸟鱼市场等场所样品共5 034份，其中禽血清样品4 344份、禽咽/腔双拭子及环境样品等病原学样品690份（包括解除封锁评估前于4月28日采集的长白岛森林公园内土壤和水样等环境样品40份）。
实验室检测
疫情诊断时所有采集的样品，经沈阳市疫控中心采用禽流感病毒核酸通用型荧光RT-PCR方法检测，阳性样品使用H5、H7及H9亚型分型检测方法进行鉴定，分型鉴定阳性样品送辽宁省疫控中心复检，复检阳性样品送哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室进行确诊；疫点封锁至解封前全市排查期间的血清学及病原学样品，由沈阳市内各县区疫控机构检测；解封前从该疫点内采集的环境样品，由沈阳市疫控中心检测。
数据分析
使用Excel 2019软件，对相关调查数据资料进行整理录入和分析；使用描述性流行病学方法，对该起疫情的三间分布进行描述，对疫情的风险来源、传入途径等提出假设并验证，对疫情的扩散风险进行分析评估。
调查结果
基本情况
饲养管理 在疫情发生前，长白岛森林公园内共饲养野禽291只，包括黑天鹅、白天鹅、大雁和赤麻鸭等水禽162只，珍珠鸡、孔雀、鸵鸟等其他陆养野禽129只，未饲养家禽。不同品种野禽通过铁丝网分隔在彼此相连的不同区域内饲养，黑天鹅、白天鹅、大雁、赤麻鸭等野生水禽均在同一处池塘及周边活动。该公园内还有其他动物观赏区，占地约5 hm2，饲养猴子25只、山羊15只、鹿12只、矮马6匹、骆驼4只、羊驼4只、驼羊2只、牦牛2头，无肉食动物。野禽和其他动物分别由不同饲养人员饲养；野禽饲料和其他动物饲料，均由当地一家饲料厂供应，近1年来未更换，公园内饲料库管理较为规范；公园内有专业兽医人员，负责野禽和其他动物的疾病诊治和日常保健工作。
免疫和治疗 通过查看该公园的免疫和诊疗记录，并经公园兽医人员证实，该公园2021年尚来开展观赏野禽的禽流感免疫工作。2021年4月6日，该公园兽医人员发现个别黑天鹅出现精神不振、厌食等异常情况，遂于当天给野生水禽全群投喂土霉素和“瘟疫清”（主要成分为金刚乙胺+地黄、黄芩、连翘等多味中药提取物）进行治疗，但未见疗效，且连续3 d出现野禽死亡，遂于4月8日上报异常情况。
野禽调入调出 调查人员通过现场查看公园的畜禽饲养管理档案、野禽饲养种类和数量等实际情况，结合公园内饲养管理人员的介绍，基本可以推断该公园今年尚未引入和调出野禽。
周边排查 该森林公园（疫点）位于沈阳市主城区内，疫点周边3 km（疫区）乃至外延5 km范围内（受威胁区）无禽养殖场户、活禽交易市场及屠宰场等禽类相关场所。自4月10日开始，沈阳市农业农村局在全市范围内组织开展禽类相关场所临床异常情况排查，并针对性开展采样监测，至5月1日疫点解除封锁前，全市共排查禽规模场0.31万个、散养户25.15万家，共排查家禽1.15亿羽，未发现异常。
临床表现及剖检症状
2021年4月6日，该森林公园内的野禽饲养管理人员发现，个别黑天鹅出现精神沉郁、厌食的异常情况，其他野禽眼观未见明显异常，当天出现黑天鹅急性死亡，随后连续3 d出现野禽死亡；4月8日，沈阳市疫控中心专家现场对当天发病死亡的黑天鹅进行解剖，观察到心冠出血（图1-A），肝脏明显肿大，表面呈黄白色，切开可见组织纤维化病变（图1-B、C），气管可见弥漫性充血和出血，胰脏浅表可见出血和坏死，小肠和直肠可见卡他性炎症及出血（图1-D）。
三间分布
时间分布 2021年4月6日，该森林公园内发现个别黑天鹅精神萎顿，并于当天发病死亡3只；4月7日，2只黑天鹅发病死亡；4月8日，5只黑天鹅和1只大雁发病死亡，当天该森林公园上报疫情。4月9—10日，经沈阳市疫控中心实验室检测、辽宁省疫控中心实验室复核，判定为疑似H5N6亚型高致病性禽流感；4月12日，经国家参考实验室确诊为H5N6亚型高致病性禽流感。本次疫情的病例时间分布见图2。
空间分布 该疫点位于沈阳市和平区长白街河堤西路（东经123.224 531?、北纬41.444 873?），紧邻浑河（辽河最大支流，长达415 km）南侧，占地约42 hm2；公园内森林覆盖率高达80%，其中包括野禽观赏区约6 hm2，周围活动和栖息的野鸟，尤其是候鸟，每年3月以后明显增多。
群间分布 本次疫情的袭击率为3.8%（11/291），病死率为100%（11/11），仅发现该公园内黑天鹅、大雁等野生水禽发病死亡，同一区域内饲养的孔雀、珍珠鸡、赤麻鸭、驼鸟等其他陆养野禽临床表现未见异常。
实验室检测
4月9日，沈阳市疫控中心从现场采集的17份样品中，检出H5亚型禽流感病毒核酸阳性3份，其中组织脏器阳性1份（Ct = 20.5）、粪便拭子阳性2份（Ct = 32~33）；4月9日晚至4月10日凌晨，经辽宁省疫控中心复核，结果仍为阳性；4月10日，送至哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室检测，4月12日，经病毒分离鉴定和测序分析，确诊为H5N6亚型高致病性禽流感，分离毒株在遗传进化分类上属Clade2.3.4.4分支，其HA基因与H5Re-11疫苗株同源性最高，达98.4%。自4月10日开始，沈阳市实施禽流感紧急免疫措施，对全市范围内家禽进行免疫状况调查，对尚未开展春季集中免疫的家禽进行强制免疫接种，并于免疫15 d后进行禽流感病毒抗体及核酸抽样检测，结果抗体合格率在85%以上，病毒核酸检测均为阴性。
病因假设与分析
通过迁徙野鸟带毒传入的可能性最大
辽宁省地处黄海和渤海之滨，全省14个地市中6个地市邻海，属温带季风气候，全球已知的9条候鸟迁徙通路中的第5条和第9条通道途经辽宁省，而沈阳市位于第5条迁徙通道上。沈阳市近年来重视生态环境建设和保护，全市境内有浑河湿地、沈阳法库湿地等大型湿地5处，总面积约86 700 hm2。据林业部门介绍，每年9月底、3月初，有144种，近百万只野鸟途径沈阳或在此越冬、繁衍生息。疫情发生地沈阳市长白岛森林公园位于浑河边上，浑河支流流入该公园野禽活动的池子；园区内森林覆盖率高，除野禽观赏区内有防禽网外，公园内其他区域无防野鸟措施，周边候鸟及留鸟可自由出入园区。另据世界动物卫生组织（OIE）通报，2020年12月以来，同处第5条候鸟迁徙通道上的一些国家及我国周边国家发生多起家禽和野禽H5亚型高致病性禽流感疫情，仅2020年12月20日至2021年1月14日，邻国越南就报道了8起家禽H5N6亚型高致病性禽流感疫情。此外，该森林公园未及时开展观赏野禽的禽流感免疫工作，野禽群体未建立起有效的禽流感免疫保护屏障，一旦病毒传入，感染发病的风险就极高。因此，推断迁徙野鸟带毒传入的可能性最大。
由水源传入的可能性不容忽视
该森林公园内野禽活动的水池与其水源地浑河湿地相通，因此浑河水源被带毒迁徙候鸟污染，禽流感病毒随水流入而被园内野禽摄入体内感染的可能性不容忽视，但从环境水样中并未检测到禽流感病毒核酸，可能与采集水样的位点、采样数量及水样中病毒含量低于检测阈值等方面因素有关，因此未检出禽流感病毒核酸并不能排除由水源地传入的可能性。
饲料、家禽及相关产品传入的可能性较小
该公园观赏鸟的饲料购自沈阳市某大型饲料厂，发生疫情前2个月内未更换饲料，现场查看公园内饲料库房管理良好，设置有防鼠和防鸟措施；对饲料库内饲料抽样进行禽流感病毒核酸检测，结果为阴性。该森林公园未饲养任何肉食动物，未从周围市场上购买家禽及相关产品带进公园内。因此，由饲料、家禽及相关产品传入的可能性较小。
人员和车辆带毒传入的可能性较小
疫点内天鹅、大雁等水禽活动的湖位于该公园中心位置，处于浑河支流上，四周环绕种植灌木并设有铁丝网，游客与湖内野禽无直接接触可能；公园内禁止游客自带食物饲喂野禽，但据园区管理人员介绍，也有个别游客投喂自带食物的情况，基本以面包、香肠等为主；园区野禽观赏区饲养员自述，近几个月内均无与公园外禽类接触史；疫点周边3 km乃至8 km范围内均无禽养殖场户、观赏鸟市场、活禽交易市场或摊点和禽屠宰场点等禽类相关场所，对沈阳市禽饲养场户进行禽流感病毒核酸抽检结果也均为阴性；和平区疾病预防控制中心对该公园内野禽饲养管理相关人员紧急采样进行了禽流感病毒核酸检测，结果均为阴性。因此，由人员带毒传入的可能性极小。该森林公园严禁外来车辆入园，仅园区内专用车辆通行，由外来车辆带毒传入的可能性也极小。
疫情扩散风险分析
该公园2021年4月6日发现3只黑天鹅出现异常并死亡，4月8日上报疫情，随后沈阳市农业农村局立即组织相关技术人员开展情况核查，并建议该公园所在的和平区政府，对园区立即采取严格封锁、消毒、无害化处理等控制措施。同时开展疫情追溯和追踪调查，结果表明2021年以来该公园未新购入及调出野禽。另外，自4月10日诊断为疑似H5亚型禽流感后，根据风险评估，认为通过候鸟或留鸟飞入飞出导致病毒扩散的潜在风险较高，为此立即对园区内禽群实施全群扑杀并无害化处理以及对园区环境进行严格消毒，同时对周边候鸟活动环境及家禽养殖场户进行抽样检测，结果禽流感核酸均为阴性。综合推断，疫情向外扩散的风险较低。
疫情处置
4月8日，经沈阳市农业农村局组织兽医专家现场临床诊断，初步怀疑发生禽流感疫情，立即建议该森林公园对野禽区采取隔离管控措施并进行严格消毒；4月10日，沈阳市和平区政府根据辽宁省疫控中心检测结果，按照《高致病性禽流感疫情应急实施方案》（2020年版）规定，立即启动重大动物疫情应急处置Ⅳ级响应，对整个野禽观赏区域采取严格的封锁、消毒、隔离措施；经过省市专家评估，科学划定了疫点和疫区，划定长白岛森林公园野禽类观赏区为疫点，划定疫点周边东至长白二街口，南至长白岛森林公园南侧路，西至胜利桥东南口二门，北至长白岛森林公园北路区域约3 km半径范围为疫区，对疫点内剩余的280只禽鸟进行全群扑杀和无害化处理，对疫点内环境进行严格消毒，第1周每天1次，第2周每2天1次，第3周每3天1次；对疫区采取流行病学调查措施。自4月10日起，沈阳市部署在辖区内各县区开展禽流感疫情紧急排查工作，并加快推进全市禽类的禽流感疫苗免疫接种工作。紧急免疫15 d后，对该森林公园环境进行采样检测，对沈阳市各县区禽类重点场所进行抽检。5月2日，沈阳市农业农村局组织相关专家对疫点、疫区进行风险评估，认为符合解除疫情封锁的规定，按照程序解除了封锁。至此，该起野禽H5N6高致病性禽流感疫情被彻底扑灭。
讨论
本次疫情为辽宁省报道的首起野禽H5N6亚型高致病性禽流感疫情。通过紧急流行病学调查分析，综合考虑疫情暴发季节、候鸟迁徙路线、周边国家疫情发生情况以及疫点及疫区周边禽类养殖场户及其他相关场所的排查及检测情况，推测由迁徙候鸟从境外带毒传入的可能性最高。从园区内环境水样、土壤等拭子样品中未检出禽流感病毒核酸，可能与4月份沈阳气候晴朗，紫外较强，使病毒不易存活有关，也与采样点较少、样本数量不足、检测方法敏感性等因素有关。由饲料、家禽及其产品、人员和车辆等携带传入的风险较低，不能排除因浑河注入公园内的水源污染传入的可能。另外，未按照免疫程序及时开展园区内野禽的禽流感免疫工作，未建立起H5亚型等高致病性禽流感免疫保护屏障，是该起野禽高致病性禽流感疫情发生的内在原因。
2019年3月辽宁省锦州市动物园发生了首起观赏孔雀H7N9亚型高致病性禽流感疫情，同年4月沈阳市新民市发生一起家禽H5N1亚型高致病性禽流感疫情，风险评估结果表明，疫情来源极可能为迁徙野鸟。因此，辽宁省兽医主管部门进一步加强了冬春季节省内候鸟迁徙活动场所的禽流感主动监测，定期采集野鸟粪便拭子进行禽流感核酸检测，并加强了冬春季节禽养殖场户的禽流感强制免疫。近年来，辽宁省未再发生家禽禽流感疫情。但2021年4月再次发生的公园内野禽H5N6亚型高致病性禽流感疫情，表明在周边国家家禽及野禽禽流感疫情严峻的形势下，加上辽宁省特殊的地理位置，由迁徙野鸟带毒传入的风险较高且持续存在。因此，辽宁省家禽养殖场户及公园、动物园、花鸟市场等野禽和观赏禽类活动场所的经营、管理者，应切实履行防疫主体责任，扎实做好禽流感强制免疫、消毒等防疫工作，加强生物安全管理，提高疫病防控意识和水平，筑牢防疫屏障；各级兽医主管部门要强化对养殖主体的防疫措施落实监管，同时要进一步加大对冬春候鸟迁徙过境季节野禽活动场所（候鸟栖息地、公园、花鸟市场等）及家禽饲养场户的日常健康排查，一旦发现异常死亡禽只，应及时采样进行禽流感病毒核酸检测，同时加大对候鸟栖息地野鸟粪便、环境水样的禽流感主动监测力度，增加监测频次，扩大监测范围，力争做到科学及时预警，有效降低疫情发生风险。
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