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2021年我国猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查与遗传变异性分析
吴慧娟，牛登云，段宝敏，秘清灵，吕钊，马利芳，史秋颖，冯敬敬*
（天津渤海农牧产业联合研究院有限公司，天津300308）
猪繁殖与呼吸综合征是由病毒（PRRSV）引起的猪的一种繁殖障碍和呼吸系统的传染病，其临床特征是母猪发热厌食，妊娠后期流产，产死胎和木乃伊胎；仔猪则发生呼吸系统疾病且大量死亡，由于部分病猪耳部发紫，俗称“蓝耳病”。
据统计，2014—2016年我国主要以HP-PRRSV为主要流行毒株，但NADC30-like毒株的检出比率呈上升趋势，直到2016年成为我国主要的流行毒株。
预防该病主要以接种疫苗为主，现阶段商品化的疫苗主要为PRRSV活疫苗和PRRSV减毒活疫苗（PRRSV-MLV），主要针对的是经典PRRSV和HP-PRRSV两类，PRRSV-MLV疫苗可以诱导保护性免疫反应，但它可能不会对所有分离株都具有广泛的交叉保护，这也导致疫苗对异源性病毒保护不完全。通过评价5种商品化疫苗也证实了现有疫苗不能对NADC30-like毒株提供完全的保护力。
2021年度本研究共检测得到132份PRRSV阳性临床样本，测序成功88个，通过基因测序发现NADC30-like有87株，占比达到98.86%，是主要的流行毒株，GP5与Nsp2与参考毒株NADC30的同源性在86.6%~95.2%和51.3%~90.9%之间，说明该毒株已出现不同程度的变异，不排除会有新型PRRSV的出现，因此对PRRSV进行不间断的分子流行病学分析具有重要意义。
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材料与方法
INTRODUCE
1.1 临床样本剖检
2021年共收集到来自全国20个省份的1 035份临床样本，均为疑似PRRSV感染的病死猪的口腔拭子、血液和剖检脏器（图1）。
1.2 主要试剂
RPMIMedium1640培养基、双抗均购自gibco；胎牛血清购自AusGeneX。
1.3 测序引物设计与合成
本研究同时检测ORF5和NSP2两段基因片段，根据GenBank上登录的参考序列设计如下引物登录的参考序列设计引物，引物扩增长度为696和999，由擎科生物科技有限公司合成。
1.4 RT-PCR鉴定
按照天隆科技核酸提取说明书，对临床样本进行核酸提取，之后采用ORF5与NSP2扩增引物进行目的基因扩增，RT-PCR反应条件为：45℃逆转录30 min；95℃cDNA预变性5 min；95℃变性30 s；59℃退火，72℃延伸30 s；72℃ 5 min；4℃ 5 min。
以上3个温度共35个循环。最终将扩增后的目的基因片段送至擎科生物科技有限公司进行测序。
1.5 猪肺巨噬细胞制备
本研究采用肺泡灌洗方法制备原代猪肺泡巨噬细胞（PAM）。
选60日龄的健康仔猪，在检测PRRSV阴性后通过前腔静脉放血处死，将肺脏在无菌条件下完整取出；用吸管通过气管向两侧肺脏中灌满含2%双抗RPMI-1640培养液，轻轻揉捏肺脏使肺泡巨噬细胞充分分散于培养液中，重复2~3次；使用无菌的6层纱布对滤液进行过滤，分装后以1 000 r/min于室温下离心10 min后去上清，按此方法用上述培养液重复对细胞进行2~3次洗涤；将洗涤后的PAM细胞用含2%~4%的双抗和10%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬后进行计数，按4×106/孔接种到所需孔板中，剩余细胞用含10%DMSO的胎牛血清冻存于液氮中备用。
1.6 病毒分离与鉴定
采集到的临床组织样本研磨后反复冻融2次，血液样本与拭子无需冻融与研磨。将上述临床样本1 000 r/min离心5 min取上清，用无菌PBS将上清液进行3倍稀释，而后用0.22 μm滤膜进行过滤，所得即为待检样本。将冻存的PAM细胞从液氮中取出并复苏，待细胞贴壁后缓慢吸出培养液，并将过滤好的病毒液按1∶2缓慢接种于细胞板孔中，37℃吸附0.5 h后吸出上清弃掉，再加入细胞维持液，放置于CO2培养箱中继续培养，每天观察细胞病变（CPE）情况，细胞病变面积达到95%时予以收获，放置-80℃冰箱放置待测。若接种PAM细胞120 h后仍无细胞病变，则继续盲传3代后进行PCR检测，若检测阴性则停止传代。
1.7 流行病学统计与遗传变异性分析
将测序得到的基因序列与NADC30、HENAN-HEB、CH-1R、CH-1a、VR-2332、MZ-IND-DBT1-18、JXA1、MN187C、R98、HUN4、TJ、GD、HENAN-XINX、QYYZ参考毒株进行比对分析，按照对应临床样本的送检地区、发病日龄、月份、临床样本类比进行统计分析。
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结果
INTRODUCE
2.1 临床样本剖检与RT-PCR鉴定
根据剖检发现该病症没有特征性的病变，根据并发与继发感染的不同，病变有差异；由于病原的靶器官为肺泡内巨噬细胞，因此肺部剖检病变明显，呈现弥散性肺实质、肺泡炎和间质纤维化的间质性肺炎特征。经RT-PCR检测临床共检测到132份阳性样本。
2.2 病毒分离
将采集到的临床样品同步接种于PAM细胞，盲传2~3代，共得到33株可稳定传代的PRRSV分离株，PAM细胞病变为皱缩、裂解并最终脱落。以上分离株细胞液经测序引物检测均能扩增出GP5和NSP2目的片段，其余临床样本接种PAM细胞传至3代后仍无细胞病变，经RT-PCR检测未得到目的基因，判定为PRRSV阴性。
2.3 流行病学统计分析
经过2021年流调分析结果显示，江西地区检出率最高，山西、内蒙古和江苏次之。研究结果显示，各种日龄的猪均易感该病，但以25和80日龄居多。其中以普通型猪蓝耳病为主，高致病性猪蓝耳病数量较少。根据送检样品类别来看，主要送检类别为血样和剖检组织，血液样品检出率最高。
2.4 Nsp2基因遗传变异性分析
将从临床样本中扩增到的目的基因送至测序公司进行测序，共得到70个Nsp2序列。
2.4.1系统进化树显示
经过基因进化树分析发现，70个Nsp2序列均属于美洲型PRRSV，可分为两个亚群，即亚群I和2（Subgroup1、2）。亚群I以NADC30，MN184C为代表的普通PRRSV分支，亚群II是以VR2332为代表的经典毒分支。亚群I中65个序列位与NADC30标准毒株和NADC30高度同源性的变异毒株HENAN-HEB/XINX亲缘关系较近，而与早期的经典毒株如CH-1a、CH-1R，以及其他代表性毒株均亲缘关系较远。6个序列位于亚群II，与传代疫苗株JXA1亲缘关系最近。
2.4.2 Nsp2同源性和遗传进化分析
经过同源性比对分析发现，亚群I中65个序列与NADC30序列相似度为71.3%~90.4%。亚群II中6个序列与JXA1相似度为86.3%~91.8%。两个亚群中的序列与HP-PRRSV及经典PRRSV均相差较远。根据序列比对显示，Nsp2具有高度变异性，且所有序列均存在氨基酸的不连续缺失。在亚群I中的65个氨基酸序列与NADC30相比，具有相同位置的氨基酸的不连续缺失，而亚群II中6个氨基酸序列与JXA1具有相同位置的氨基酸的不连续缺失，对比发现目前并没有出现新的缺失部位。
2.5 GP5基因遗传变异性分析
本研究测得GP5基因序列共有53个，系统进化树结果与Nsp2相似，分以NADC30为代表的亚群I和以VR2332为代表的亚群II（Subgroup1、2）2.5.1 系统进化树显示
NADC30标准毒株与NADC30高度同源的变异毒株HENAN-HEB与HENAN-XINX，以及NADC30-like毒株代表MN184C均分布于亚群I中，而亚群I中的46个序列与早期标准毒株以及其他代表性毒株亲缘关系相对较远。亚群II中的5个序列整体与JAX1亲缘关系最近。
2.5.2 GP5同源性和遗传进化分析
53个GP5序列的同源性为79.4%~100%。亚群I中48个序列与对照毒株NADC30的同源性是86.6%~95.2%，为最高。亚族2中4个序列与对照序列JXA1的同源性最高，为99.1%~99.4%，另一个与VR-2332同源性最高，为99.2%。两个亚族中的序列经比较均与HPPRRSV相差较远。根据序列比对发现，在亚群I中每一地区的GP5蛋白序列几乎一致，但也存在一些突变位点和缺失，据分析，亚群I氨基酸残基在33，151，192，221发生了不同程度的突变，亚群II则仅在33发生了不同程度的突变。所有鉴定毒株在72并未产生其他突变，分别为P和L，与参考毒株相符（表1）。亚群II中的SD210724A-2与JAX1的氨基酸位点几乎一致，其余突变位点与NADC30相近。如54，68，78等位置均与NADC30氨基酸位点相同。整体比较GP5相对保守，但此次分析发现在73和74出现了6处氨基酸的缺失部分，分别为HeB1226B-1/-3，SD210724A-4/-5以及SD210601。
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讨论
INTRODUCE
本研究显示PRRSV仍具有全国流行性的态势，各个阶段的猪只均易感，并没有明显的季节流行性。检测结果以普通型猪蓝耳病为主，高致病性猪蓝耳病的检出率则已趋向于0，目前PRRSV活疫苗的免疫保护期一般为4～5个月，因此在合适时间进行疫苗或其他合理方式防御该病，控制继发感染，可以降低发病率。但是减毒活疫苗滥用的情况一直存在，不科学的疫苗使用伴随着多种新型毒株的出现，使得我国猪蓝耳病发病变得复杂且难以控制，因此对于猪蓝耳病疫苗的制作与使用应当严格把控。对于此次检测地区来看，送检的类别主要还是以血液为主，此方法可以最大限度的保护被检测猪群，且较为方便。但血清的高送检数量却拥有较低的检出率，应该与发病时间和采样阶段有关，这一点需要在日后检测中加以重视。
综上所述，目前我国NADC30-likePRRSV已经取代了HP-PRRSV成为了我国主要的流行毒株。对于现有疫苗不能对NADC30-like毒株提供完全的保护力的情况看，对于此类新型毒株应该加强调查它的流行规律以及遗传变异情况。本次调查对大量的毒株进行基因组序列的详细分析，为这类病毒的进一步探究和防控提供重要的数据支撑。
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